阿霉素诱导小鼠红白血病MEL细胞免疫原性死亡的实验研究

论文摘要

研究背景与目的化疗、手术、放疗是目前肿瘤三大主要治疗方法。随着研究的进展,肿瘤的免疫治疗越来越显示其在肿瘤治疗中的作用,已成为第四大治疗方法。肿瘤抗原表达缺失和机体对肿瘤的免疫耐受是导致肿瘤不能被机体识别攻击的重要原因,最近肿瘤细胞的“免疫原性死亡”这一现象的发现和概念的提出对抗原在肿瘤表面表达以及机体对肿瘤的识别又有了新的认识。以往的理论认为：化疗作为肿瘤的传统治疗方式之一,主要是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤。但是,在一个或几个化疗周期之后,大多数病人只是有部分疗效,病人还会复发,或者发生耐药抵抗,有的甚至出现完全缓解后休眠期肿瘤细胞发生微小残留病而导致治疗失败。为了克服这些困难,有2个解决办法：1.通过化疗药物的组合和治疗时间安排设计一个方案来有效的清除肿瘤细胞。比如目前血液肿瘤科医生常用的化疗组合,就是根据化疗药物杀伤瘤细胞的时相性、不同治疗时期瘤细胞在人体内时间和空间上的变化、协同效应等因素研究出来的。2.可通过使用一套免疫性的疫苗来制定出肿瘤靶向治疗方案,诱导产生清除残余瘤细胞的免疫反应。直观上看,这两种治疗办法是相互矛盾的,因为化疗对人体免疫力有很大抑制性,特别是随着总药量的逐步上升,抗肿瘤效应越强,免疫抑制也越明显。而且普遍认为,化疗主要机制是诱导细胞凋亡,凋亡是免疫静止或者免疫耐受的细胞死亡形式,是不具有免疫性的。但是,最近有学者提出：以往认为细胞死亡较为常见的两种方式凋亡和坏死中,凋亡是无免疫原性的或是免疫耐受的,坏死则会引起强烈的免疫反应,但以上推断与实验结果是不一致的。尽管从形态学的角度看,凋亡是均一的生理过程,但从细胞凋亡过程中表面分子表达的角度看凋亡并非是均一的生理过程。因此,凋亡又可根据凋亡细胞表面能否表达引起机体免疫攻击的蛋白分子分为生理性死亡和免疫原性死亡（immungentic cell death）。目前Michel Obeid等在研究实体瘤时发现,蒽环类化疗药物在诱导结肠癌CT26细胞、MCA205瘤细胞发生凋亡的同时,通过促进凋亡中瘤细胞表面表达引起机体免疫攻击的蛋白分子,从而引起抗肿瘤免疫反应,称之为肿瘤细胞的免疫原性死亡（immungentic cell death）。其研究结果显示：传统化疗药物中仅蒽环类药物具有诱导凋亡中的瘤细胞表面发生钙网蛋白（calreticulin, CRT）的大量暴露而产生免疫原性,从而诱导抗同种肿瘤的免疫作用,其他药物因不能引起细胞表面钙网蛋白的暴露而没有免疫原性。这给了我们新的提示：化疗药物对肿瘤细胞除了直接的细胞毒性作用之外还能够诱导细胞发生免疫原性死亡。如何综合多种手段提高肿瘤免疫治疗疗效,利用好肿瘤免疫原性死亡的标志性分子,对于肿瘤的免疫化疗意义深远。目前,关于肿瘤细胞免疫原性死亡的研究大多集中在实体瘤（例如结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤）领域,而且都偏向于细胞体外实验,尤其是钙网蛋白的研究。在血液系统恶性肿瘤领域中关于该方面的研究甚少,尤其是建立小鼠模型方面尚无相关报道。我们首先将小鼠红白血病MEL细胞种植于具有正常免疫功能的昆明（KM）小鼠体内,建立了适合免疫原性死亡研究的小鼠红白血病模型。在此基础上,选取了蒽环类化疗药物阿霉素（adriamycin, ADM）作用于MEL细胞,参考Michel Obeid等的小鼠实验方法,进行小鼠体内实验,观察小鼠是否发生抗MEL细胞免疫应答现象,观察肿瘤细胞的免疫原性死亡现象是否也存在于血液系统恶性肿瘤疾病中。实验方法第一部分阿霉素诱导小鼠红白血病MEL细胞凋亡的实验研究Michel Obeid等发现蒽环类药物作用瘤细胞后使其发生接近70%±10%凋亡比率时可诱导结肠癌CT26细胞、MCA205瘤细胞发生免疫原性死亡,低于或高于70%±10%凋亡比率时都不能诱发免疫原性死亡。为研究蒽环类药物能否诱导MEL细胞的免疫原性死亡,参照Michel Obeid的报道,我们用ADM进行研究,先确定ADM浓度变化与MEL细胞凋亡情况的关系,确定诱导MEL细胞发生约70%凋亡比率的ADM浓度。我们设置了1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL的ADM梯度浓度处理MEL细胞,使用流式细胞术检测MEL细胞凋亡（DAPI-/Anne V+与DAPI+/Anne V+比例之和）,确定ADM靶浓度（DAPI-/AnneV+与DAPI+/AnneV+比例之和约为70%的ADM浓度）。取对数生长期的MEL细胞接种于6孔板（1×106 cells/well）,990μL/well细胞悬液。取出ADM母液倍比稀释后各取10μL加入每孔细胞悬液中,使ADM终浓度为1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL。每个浓度重复6孔。共孵育24h后收集每孔细胞于1.5mlEP管中行下列2项操作：（1）细胞形态检测：①光学显微镜下观察MEL细胞形态。②Hoechst 33258染色观察MEL细胞核变化。（2）流式细胞术检测：采用流式细胞术检测MEL细胞凋亡。实验重复3次,每次均设阴性对照。第二部分红白血病小鼠模型的建立收集对数生长期MEL细胞于离心管,1000r/min,5min,去上清,加PBS洗3次,PBS重悬调整细胞密度为5×106cells/mL。每只雄性KM小鼠经尾静脉接种1×106个（0.2mL） MEL细胞,共接种10只。判断红白血病小鼠模型是否建立的观察指标：（1）生存时间：①小鼠首只发病死亡的时间（Td1）、小鼠半数致死时间（T1/2d）、小鼠全部发病死亡时间（Tdt）,小鼠总生存时间（Tt）。（2）细胞形态学检查：①外周血（PB）：小鼠濒死或80d时断尾取外周血计数白细胞总数,留取外周血涂片行瑞氏-吉姆萨染色,在光镜下观察细胞形态并计数有核细胞百分率；②骨髓（BM）：濒死小鼠颈椎脱臼法处死后立即进行骨髓原始细胞百分率的检测。制作骨髓涂片行瑞氏-吉姆萨染色后于光学显微镜下计数500个有核细胞,对细胞进行分类计数。（3）组织病理学检查：待小鼠濒死时处死,取小鼠的肝、脾、骨髓制成石蜡切片,HE染色后在光镜下观察,确定小鼠的死亡原因。第三部分阿霉素诱导小鼠红白血病MEL细胞免疫原性死亡的实验研究为进一步确定ADM诱导的MEL凋亡细胞在红白血病小鼠体内能否诱导抗肿瘤免疫现象,我们进行了小鼠体内实验。30只雄性KM小鼠随机分为小鼠红白血病模型组（模型组）、ADM素诱导治疗组（实验组）、空白对照组（对照组）,10只/组。模型组（A）：尾静脉注射无菌PBS,200gL/只。8d后收集对数生长期的MEL细胞行尾静脉注射,1×106cells/只（200μL）。实验组（B）:ADM靶浓度（通过流式细胞术确定为4μg/mL）与MEL细胞于培养瓶中共孵育24 h,离心收集,调整细胞密度至9×106cells/只（200μL）,行尾静脉注射。8 d后与A组处理相同。对照组（C）：不做任何人为干预。每隔1～2 d观察小鼠,小鼠濒死时或存活至第80天时检测小鼠外周血白细胞（WBC）总数及体重,记录小鼠患病情况和生存时间。主要观察指标：①各组小鼠首只发病死亡时间（Td1）、小鼠半数致死时间（T1/2d）、小鼠全部发病死亡时间（Tdt）,各组小鼠总生存时间（Tt）。②小鼠濒死或研究终止时外周血WBC计数。③小鼠濒死或研究终止时体重。统计学方法实验结果计量资料采用均数±标准差（x±s）表示,显著性标准为P<0.05,采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。组间比较用单因素方差分析（One—way ANOVA）;组间两两显著性比较方差齐采用LSD法,方差不齐用Dunnett’s T3。生存时间采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果第一部分阿霉素浓度与小鼠红白血病（MEL）细胞凋亡比率存在剂量依赖效应关系,4μg/mL阿霉素诱导小鼠红白血病（MEL）细胞发生约70%凋亡率ADM可诱导MEL细胞发生凋亡,且ADM浓度越大,致使MEL细胞发生凋亡的比率也越大,二者之间呈现剂量依赖效应关系。（1）细胞形态检测：①光学倒置显微镜下观察：MEL细胞呈圆形,大小较均一,折光性好,透亮,边缘清楚。ADM处理24 h后,MEL细胞生长状态变差,部分细胞出现皱缩,胞体变小,细胞碎片增多,折光性减弱,胞质中出现空泡。②Hoechst33258染色后荧光显微镜下显示：MEL细胞核呈圆形,大小比较一致,荧光强度比较均一。ADM处理24 h后的MEL细胞有部分出现细胞核浓缩,可见凋亡小体。（2）流式细胞术检测：ADM浓度与MEL细胞凋亡比率存在剂量依赖效应关系。4μg/mLADM可诱导MEL细胞发生约70%凋亡率（即流式细胞术检测结果DAPI-/AnneV+与DAPI+/AnneV+比例之和约为70%）,此为研究MEL细胞免疫原性死亡的ADM靶浓度。第二部分尾静脉输注小鼠红白血病MEL细胞于KM小鼠可建立红白血病小鼠模型KM小鼠尾静脉输注MEL细胞（1×106/只）后100%发病,其中小鼠开始发病死亡时间（Td1）为13天、小鼠半数致死时间（T1/2d）为26天、小鼠全部发病死亡时间（Td2）为46天,小鼠总生存时间（Tt）为（26.80±10.98）天。发病小鼠外观消瘦、弓背、懒动、少食、毛色晦暗、跛行,其肝、脾明显肿大。小鼠濒死时外周血白细胞计数明显升高。濒死小鼠外周血涂片幼稚红细胞占3%—6%,以中、晚幼红细胞为主,可见原始和早幼红细胞。骨髓涂片示有核细胞增生明显活跃,红系及粒系增生明显；幼红细胞≥50%,以原始和早幼红细胞为主,可见双核。NEC中原始细胞≥30%,原始粒细胞呈圆形,染色质细致,核仁明显,胞质少。符合急性红白血病的诊断标准。取发病小鼠肝、脾、骨髓行病理学检查,镜下见肝、脾正常组织结构破坏,有弥漫性白血病细胞浸润；高剂量组在心脏、肾脏组织中都能发现肿瘤细胞浸润；血管内有瘤细胞淤滞。组织中肿瘤细胞形态较培养瓶中的MEL细胞有所改变。骨髓中白血病细胞浸润,原始及幼稚红细胞、粒细胞比例明显增加。结合白细胞数目、细胞形态学和病理组织学等综合评定尾静脉输注小鼠红白血病MEL细胞（1×106／只）于KM小鼠可建立红白血病小鼠模型。本模型的红白血病小鼠具有天然免疫功能。第三部分预输注经阿霉素诱导凋亡的小鼠红白血病（MEL）细胞于红白血病小鼠,可延长红白血病小鼠的生存时间①小鼠首只发病死亡的时间（Td1）、外周血WBC数目、体重（第1只死亡小鼠）：A组：14天,10.3×109/L,21.3g；B组：32天,8.6×109/L,35.5g。②：小鼠发病死亡达半数的时间（T1/2d）、外周血WBC数目、体重（第5只死亡小鼠）：A组：27天,16.2×109/L,27.2g；B组：56天,10.1×109/L,39.8g。③全部小鼠发病死亡时间（Tdt）、外周血WBC数目、体重（第10只死亡小鼠）：A组：44天,19.2×109/L,30.8g;B组：当A组小鼠全部死亡时,B组仍有9只小鼠存活,实验终止时,B组仍有1只小鼠存活,其外周血WBC数目为6.7×109/L,体重为45.0g；B组第9只小鼠发病死亡的时间、外周血WBC数目、体重为：64天,15.1×109/L,42.1g；而C组：观察80天,全部存活,其总生存时间（Tt）、外周血WBC数目、体重为：（80.00±0.00）天,（5.81±0.88）×109/L,（45.91±2.14）g。A、B、C组总生存时间（Tt）、外周血WBC数目、体重：①总生存时间（Tt）分别为：28.00±8.43、56.00±12.68、80.00±0.00。②总外周血WBC数目分别为：16.06±3.38、11.02±2.69、5.81±0.88;③总体重分别为：28.42±4.33、40.24±3.22、45.91±2.14；A、B组总生存时间、外周血WBC数目、体重和较C组分别均缩短、升高、降低。但是,B组小鼠较A组小鼠而言：总生存时间延长（P<0.01）,外周血WBC数目降低（P<0.01）,体重增加（P<0.01）。结论1.建立了小鼠红白血病MEL细胞尾静脉输注昆明小鼠的红白血病小鼠模型,其与人红白血病的病理生理相似。本模型的红白血病小鼠具有天然免疫功能。2. 4μg/mL的阿霉素作用于小鼠红白血病MEL细胞24 h后其凋亡率约为70%。3.预输注经阿霉素诱导约70%凋亡率的小鼠红白血病MEL细胞于红白血病小鼠,可延长其生存时间以及降低其体内瘤负荷水平,即阿霉素在红白血病细胞中也可以产生免疫原性死亡现象。本研究的创新点：建立了小鼠红白血病MEL细胞接种于昆明小鼠的急性红白血病小鼠模型,本模型的红白血病小鼠具有天然免疫功能；证实了阿霉素诱导小鼠红白血病MEL细胞产生抗肿瘤免疫应答的免疫原性死亡现象。本研究的价值：目前有关肿瘤免疫原性死亡的实验研究集中于实体瘤方面,较少涉及血液系统恶性肿瘤,本实验进行了血液系统恶性肿瘤细胞免疫原性死亡的初步研究,观察到预输注经阿霉素诱导约70%凋亡率的小鼠红白血病MEL细胞于红白血病小鼠,可延长其生存时间以及降低其体内瘤负荷水平的抗肿瘤免疫现象。为进一步研究血液系统恶性肿瘤细胞免疫原性死亡机制和应用提供了实验基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 阿霉素诱导小鼠红白血病MEL细胞凋亡的实验研究
• 引言
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二部分 红白血病小鼠模型的建立
• 引言
• 1. 实验动物和细胞
• 2. 实验方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第三部分 阿霉素诱导的小鼠红白血病MEL细胞免疫原性死亡的实验研究
• 引言
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 统计学处理
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 6. 小结
• 本研究尚待进一步探索的问题
• 参考文献
• 综述
• 中英文缩略词表
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文
• 统计学审稿合格证明