胆固醇氧化酶产生菌Enterobacter sp.的筛选及其酶分离纯化的研究

论文摘要

胆固醇是机体内重要的固醇类物质,它具有多种多样的生理功能,但是体内过多的胆固醇却是引起冠心病、动脉硬化和心肌梗塞的危险因素之一。胆固醇氧化酶（COD,EC 1.1.3.6）是一类黄素蛋白,属于GMC氧化还原酶体系,它能催化胆固醇分解成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢,是胆固醇代谢过程中的第一个酶,也是一个关键酶,它能够快速准确地检测出血清中胆固醇的浓度,用来诊断动脉硬化和其他脂质紊乱疾病;能够降低食品中的胆固醇含量,有益于人类健康;能够有效地杀灭鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目和同翅目的害虫,是一种安全有效的生物杀虫剂;此外,胆固醇氧化酶氧化胆固醇生成的胆甾-4-烯-3-酮在治疗肥胖等方面具有应用前景。本研究的目的是获得大量来源的胆固醇氧化酶,以满足工业和医疗领域的需要,从不同的环境中筛选得到了14株高产胞外胆固醇氧化酶（COD）的菌株,其中胆固醇氧化酶活性最高的一株菌,命名为COX8-9,通过菌体形态,菌落特征,生理生化反应和16SrDNA基因全序列分析,初步鉴定该菌属于肠杆菌属（Enterobacter）。利用单因子实验和正交实验对菌株COX8-9产胆固醇氧化酶摇瓶发酵的培养基及培养条件进行优化。结果表明,发酵培养基的最佳成份为:胆固醇0.2%,酵母粉0.5%,可溶性淀粉0.5%,CuSO4·5H2O 0.001%,吐温-80 0.3%, NH4NO30.1%,KH2PO40.025%,MgSO4·7H2O 0.025%, FeSO40.0001%,pH 7.0 ,最适培养条件为接种量5%,种龄15h18h,摇瓶装量为30mL培养基/250mL三角瓶,30℃,200r/min,发酵48 h,胆固醇氧化酶活力可达到748U/L。菌株COX8-9的发酵上清液经过超滤后,连续两次通过不同pH值的Q-sepharose柱,再过superdex-75凝胶过滤色谱,得到了纯化的胆固醇氧化酶。纯化的胆固醇氧化酶是分子量为58 kDa的单体酶,在280nm处有最大吸收峰。该酶氧化胆固醇的Km值为1.19×10-4 mol/L,最适温度为25℃,在40℃以下都比较稳定;最适pH为7.0,而在pH9.0时最稳定;金属离子Cu2+可以提高胆固醇氧化酶的活力,可将其提高三倍;在30℃温度下,该酶在长期的水溶液储存条件下都比较稳定,表明了该酶作为临床诊断试剂的潜力。其他筛选菌株的胆固醇氧化酶的鉴定及制备工作正在进行中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 胆固醇概论
• 1.1 胆固醇的分布
• 1.2 胆固醇的合成与代谢
• 1.3 胆固醇的生理功能
• 1.4 血液胆固醇超标对人体的危害
• 1.5 调节人体血清胆固醇含量的对策
• 2 胆固醇氧化酶的研究进展
• 2.1 胆固醇氧化酶的微生物来源
• 2.2 胆固醇氧化酶的基本特性
• 2.3 胆固醇氧化酶的结构
• 2.4 胆固醇氧化酶的生物学功能
• 2.5 胆固醇氧化酶降解胆固醇的研究
• 2.6 酶法测定胆固醇
• 3 胆固醇氧化酶基因克隆及序列分析
• 3.1 链霉菌（Streptomyces sp.）的胆固醇氧化酶基因choA
• 3.2 甾短杆菌（Brevibacterium sterolicum）的胆固醇氧化酶基因choB
• 3.3 choA 与choB 的比较
• 3.4 马红球菌（Rhodococcus equi）的胆固醇氧化酶基因choE
• 3.5 胆固醇氧化酶基因与基因工程
• 4 胆固醇氧化酶的分离纯化
• 4.1 胆固醇氧化酶的提取
• 4.2 胆固醇氧化酶的纯化
• 5 胆固醇氧化酶的应用
• 5.1 临床诊断
• 5.2 食品方面
• 5.3 制药工业
• 5.4 农业方面
• 5.5 工具酶
• 6 本文研究的主要内容
• 第二章 胆固醇氧化酶产生菌的筛选及鉴定
• 1 材料
• 1.1 样品来源
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 培养基
• 1.4 主要药品
• 1.5 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 胆固醇氧化酶活力的测定
• 2.2 菌株的筛选
• 2.3 菌株的鉴定
• 3 结果与讨论
• 3.1 胆固醇氧化酶产生菌的筛选
• 3.2 菌株的鉴定
• 4 小结
• 第三章 COX8-9 菌株摇瓶发酵培养基及发酵条件的优化
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 培养基
• 1.4 主要药品
• 1.5 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 发酵培养基优化
• 2.2 发酵条件优化
• 2.3 最佳培养基和最佳发酵条件的确定
• 3 结果与讨论
• 3.1 发酵培养基优化
• 3.2 发酵条件的优化
• 3.3 最适培养基和培养条件的确定
• 4 小结
• 第四章 胞外胆固醇氧化酶的分离纯化
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 培养基
• 1.4 主要药品
• 1.5 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 胆固醇氧化酶的纯化
• 2.2 平板法快速检测胆固醇氧化酶活力
• 2.3 蛋白浓度的测定
• 2.4 胆固醇氧化酶分子量的测定
• 3 结果
• 3.1 胆固醇氧化酶的纯化
• 3.2 胆固醇氧化酶分子量的测定
• 4 讨论
• 第五章 胆固醇氧化酶的性质研究
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 培养基
• 1.4 主要药品
• 1.5 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 胆固醇氧化酶的吸收光谱和辅酶FAD 的确定
• 2.2 胆固醇氧化酶的最适温度及温度稳定性研究
• 2.3 胆固醇氧化酶的最适pH 及酸碱稳定性研究
• 2.4 胆固醇氧化酶的存放稳定性研究
• m）的测定'>2.5 米氏常数（K_m）的测定
• 2.6 化合物及金属离子对胆固醇氧化酶的影响
• 2.7 胆固醇氧化酶的底物专一性
• 3 结果与讨论
• 3.1 酶的吸收光谱和辅酶FAD 的确定
• 3.2 胆固醇氧化酶的最适温度及温度稳定性研究
• 3.3 胆固醇氧化酶的最适pH 及pH 稳定性研究
• 3.4 胆固醇氧化酶的存放稳定性研究
• m'>3.5 胆固醇氧化酶的K_m
• 3.6 化合物及金属离子对胆固醇氧化酶的影响
• 3.7 胆固醇氧化酶的底物专一性
• 4 小结
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢
• 读硕士期间发表文章情况