人MSC灌注生物反应器培养及其与生物材料生物相容性研究

论文摘要

目的:本研究拟建立组织工程种子细胞人骨髓间充质干细胞(MSC)灌注生物反应器体外培养(扩增)方法;并通过MSC与新型可降解材料生物相容性的体外研究,建立一种基于MSC的生物相容性体外评价方法。 方法:研制一套灌注生物反应器系统,在完成性能、功能测试(C2C12灌注培养)后进行MSC灌注培养研究;建立离/在线监测体系,检测MSC形态、生长代谢、增殖和成骨分化能力的变化。在生物相容性研究中,利用MSC的增殖与分化能力作为指标,通过扫描电镜观察MSC在可降解偏磷酸钙(dCMP)表面粘附的情况,并利用ICP和IC分析dCMP和羟基磷灰石(HA)的降解产物元素含量,同时采用FACS检测细胞周期变化、ALP活性分析及ARS染色两种方法检测MSC成骨分化能力,从而实现对降解产物毒性效应的检测。 结果:灌注生物反应器系统在结构上具有合理性和可靠性。通过离/在线监测体系,发现对C2C12细胞形态无显著不良影响情况下,可显著性缩短细胞群体倍增时间:对MSC的细胞形态、代谢、增殖和分化能力无显著不良影响;提高培养基的使用效率,具有安全性、可行性和一定的高效性。在生物相容性研究中,dCMP对MSC的增殖有促进作用,且不影响MSC的成骨分化进程及分化后的矿化功能;而HA对MSC的成骨分化进程无影响,但对MSC的增殖和成骨分化后的矿化功能均有抑制作用。 结论:MSC可在灌注生物反应器中实现体外培养(扩增);灌注生物反应器基本构建完成。同时,基本建立基于MSC的生物相容性体外评价方法;dCMP的生物相容性较HA为佳,更适合作为骨替代材料。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 MSC的基础研究
• 1.1.1 MSC的发现及其特征
• 1.1.2 MSC的成骨分化
• 1.2 MSC的应用研究
• 1.2.1 MSC的应用领域
• 1.2.2 骨组织工程的研究进展
• 1.2.2.1 种子细胞
• 1.2.2.2 生物材料及细胞因子
• 1.2.3 组织工程中的生物相容性研究
• 1.3 干细胞生物反应器体外培养的研究进展
• 1.3.1 动物细胞培养生物反应器
• 1.3.1.1 通气搅拌式（stir tank）
• 1.3.1.2 中空纤维管式（hollow fiber）
• 1.3.1.3 气升式（air lift）
• 1.3.1.4 填充床（packed bed）
• 1.3.1.5 透析式（dialysis）
• 1.3.2 干细胞的生物反应器培养
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要实验材料
• 2.2 主要实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 MSC成骨诱导
• 2.3.3 生物材料接种细胞的方法
• 2.3.4 相差显微镜观察
• 2.3.5 扫描电镜观察
• 2.3.6 生长曲线
• 2.3.7 细胞群体倍增时间
• 2.3.8 MTT法分析增殖能力
• 2.3.9 流式细胞术检测
• 2.3.10 细胞生长代谢情况的离线检测方法
• 2.3.11 胞内碱性磷酸酶定量分析
• 2.3.12 矿化结节茜素红染色
• 2.3.13 材料及浸提液的制备和元素分析
• 2.3.14 统计方法
• 第三章 MSC灌注生物反应器培养的初步研究
• 3.1 灌注生物反应器的设计、构建与测试
• 3.1.1 灌注生物反应器的设计与构建
• 3.1.1.1 设计采用的基本生物反应器类型
• 3.1.1.2 设计的思路与方法
• 3.1.1.3 灌注生物反应器系统流程与部件
• 1) 主体培养部件
• 2) 流速控制部件
• 3) 系统气体交换与温度的控制
• 4) 附属支架系统
• 3.1.2 灌注生物反应器性能测试实验
• 3.1.2.1 实验目的
• 3.1.2.2 测试步骤
• 3.1.2.3 结果与分析
• 3.1.3 灌注生物反应器功能评价实验
• 3.1.3.1 实验目的
• 3.1.3.2 实验策略与路线
• 3.1.3.3 结果
• 1) 细胞形态的相差显微镜观察
• 2) 生长曲线（包括倍增时间）
• 3) 生长代谢情况
• 3-1) 葡萄糖浓度的变化情况
• 3-2) 乳酸浓度的变化情况
• 3-3) 乳酸脱氢酶活性的变化情况
• 3-4) 碱性磷酸酶活性的变化情况
• 3.2 MSC灌注生物反应器培养
• 3.2.1 实验目的
• 3.2.2 策略与路线
• 3.2.3 结果
• 3.2.3.1 MSC灌注生物反应器培养
• 1) 细胞形态的相差显微镜观察
• 2) 生长曲线（包括倍增时间）
• 3) 生长代谢情况
• 3-1) 葡萄糖浓度的变化情况
• 3-2) 乳酸浓度的变化情况
• 3-3) 乳酸脱氢酶活性的变化情况
• 3-4) 碱性磷酸酶活性的变化情况
• 3.2.3.2 经灌注生物反应器培养子一代MSC细胞增殖、分化潜能检测
• 1) 经灌注生物反应器培养子一代MSC细胞的增殖能力
• 2) 经灌注生物反应器培养子一代MSC细胞的成骨分化潜能
• 2-1) 细胞分化检测Ⅰ（碱性磷酸酶定量分析）
• 2-2) 细胞分化检测Ⅱ（矿化结节茜素红染色）
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于C2C12细胞群体倍增时间与细胞密度峰值
• 3.3.2 关于MSC细胞群体倍增时间与细胞密度峰值
• 3.3.3 流速控制
• 3.3.4 在线监测细胞代谢的问题
• 3.3.5 关于取样方式
• 3.3.6 关于灌注生物反应器的安全性与高效性
• 3.4 本章小结
• 3.5 附图
• 第四章 MSC与新型可降解材料生物相容性的体外实验研究
• 4.1 实验目的
• 4.2 实验策略与路线
• 4.3 结果
• 4.3.1 浸提液元素分析
• 4.3.2 直接接触法的相差显微镜观察
• 4.3.3 直接接触法的扫描电镜观察
• 4.3.4 浸提液法细胞增殖的流式细胞术检测
• 4.3.5 浸提液法细胞分化检测Ⅰ（碱性磷酸酶定量分析）
• 4.3.6 浸提液法细胞分化检测Ⅱ（矿化结节茜素红染色）
• 4.4 讨论
• 4.4.1 生物材料对MSC形态学、增殖与分化的影响
• 4.4.2 浸提液元素含量与实验结果的关系
• 4.4.3 全量换液与半量换液两种培养方式的比较
• 4.5 本章小结
• 4.6 附图
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表的论文及科研成果清单
• 致谢