马传染性贫血病毒受体选择剪接变异体的鉴定及功能性研究

论文摘要

病毒特异性的细胞受体是病毒入侵细胞的门户,决定病毒的宿主范围、组织及细胞嗜性。从受体角度阐明病毒入侵机制,是病毒性疾病的药物研发及疫苗研制的重要方面。选择性剪接可使同一基因编码出功能不同蛋白,选择性剪接对满足生物体复杂性所需蛋白多样性具有重要意义。鉴定不同选择性剪接变异体的功能已成为生物学界研究的热点。马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus, EIAV）受体（ELR1）是2005年Zhang等通过克隆表达技术发现的,其属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）蛋白家族,本研究在原代培养的马的单核巨噬细胞上克隆ELR1的过程中,发现其mRNA基因序列存在选择性剪接形式,即其cDNA序列除所报导的序列ELR1外,还存在插入序列ELR1-IN和缺失序列ELR1-DE,ELR1-IN在已公布的序列的786-787位之间插入153bp,ELR1-DE型序列缺失了所公布序列415-478位64bp。不论序列的插入还是缺失均导致编码框的移位,而产生截短的受体多肽片段。为定量各种形式受体在体内的表达比率,本研究建立了可以特异性检测各种形式受体表达比率的SYBR Green real-time RT-PCR方法。该方法通过在不同的位置设计引物来分别定量三种形式剪接体（ELR1+ELR1-IN+ELR1-DE）、两种形式剪接体（ELR1+ELR1-IN）及插入型剪接体（ELR1-IN）的拷贝数,通过运算就可以定量出每种剪接体的拷贝数并确定它们之间的表达比率。同时为减少实验误差,本研究仅采用插入型序列质粒来构建标准品,每对引物均应用这个标准品来定量各自所扩增基因的拷贝数,这样就减少了标准品之间差异所造成的误差。并通过比较了三对不同引物扩增同一标准品的符合程度确定这种方法可行。应用这种方法定量出每种形式受体的表达比率为ELR1-IN:ELR1-DE:ELR1=3:1.7:1。为确定各种形式选择性剪接变异体的蛋白表达形式,本研究将每种剪接变异体序列均连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）上,构建成真核表达质粒,转染入293细胞和Hela细胞,通过间接免疫荧光和Western-blot证明各种形式受体均可表达,膜结合型受体ELR1表达蛋白49ku,且均表达在细胞膜上,插入型受体ELR1-IN表达蛋白大小在38ku左右,以可溶性形式表达,缺失型序列ELR1-DE可以以第二个编码区编码蛋白,表达蛋白大小在36ku左右,表达在细胞膜上。为研究可溶性受体的功能,本研究分别构建了稳定表达膜结合型受体和稳定表达插入型受体的293细胞系,分别命名为293-ELR1和293-ELR1-IN,通过real-time RT-PCR和RT酶活性检测,结果表明293-ELR1细胞系可以支持EIAV的驴胎皮肤细胞弱毒FDDV毒株的进入及复制,而对于293-ELR1-IN细胞系,推测仅可以支持病毒的进入,并不能支持病毒的复制。将插入型序列的真核表达质粒转染293-ELR1细胞并以真核表达载体pcDNA3.1（+）及未转染的空白293-ELR1细胞为阴性对照,转染后接种FDDV毒株并应用RT酶活性检测病毒活性,结果表明转染插入型序列质粒的受体组病毒活性明显低于转染真核表达载体pcDNA3.1（+）及未转染的空白293-ELR1细胞中病毒的活性,说明插入型序列表达的可溶性受体可以明显抑制FDDV毒株的感染表达膜结合型病毒受体的细胞系。为进一步研究病毒与受体相互作用的机制,针对病毒受体的特异性抗体是后期实验所必需的,故本实验又构建了ELR1基因的完整编码区及胞内区的原核表达体系,并实现了其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备ELR1蛋白多克隆抗体及从受体角度阐明EIAV减毒活疫苗的免疫保护机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 马传染性贫血病毒概述
• 1.1.1 EIAV 认知历史和现状
• 1.1.2 EIAV 形态结构和理化特性
• 1.1.3 EIAV 的生物学特性
• 1.1.4 EIAV 的致病性
• 1.2 病毒的细胞受体
• 1.2.1 病毒受体的本质
• 1.2.2 病毒受体的特征
• 1.2.3 受体介导病毒进入细胞
• 1.2.4 病毒受体选择性剪接变异体在病毒感染中的作用
• 1.2.5 病毒受体峡谷学说
• 1.2.6 病毒受体的研究方法
• 1.2.7 病毒突变的累积可能最终改变其细胞嗜性
• 1.3 马传染性贫血病毒细胞受体
• 1.4 真核生物 pre-mRNA 选择性剪接研究进展
• 1.4.1 mRNA 前体剪接基本过程
• 1.4.2 选择性剪接的基本形式
• 1.4.3 选择性剪接基因及其剪接形式的识别
• 1.4.4 选择性剪接的调节
• 1.4.5 选择性剪接的功能与调控研究
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 实验一 马传染性贫血病毒受体选择性剪接变异体的发现及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 主要试剂及工具酶
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 马白细胞的分离与培养
• 2.2.2 选择性剪接变异体的发现
• 2.2.3 选择性剪接变异体的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 选择性剪接变异体的发现结果
• 2.3.2 选择性剪接变异体的鉴定结果
• 2.4 讨论
• 3 实验二 马传染性贫血病毒受体选择性剪接变异体的准确定量
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物的设计
• 3.2.2 目的基因的鉴定
• 3.2.3 标准曲线的制作
• 3.2.4 实时荧光定量检测方法的复合率及敏感性试验
• 3.2.5 样品制备
• 3.2.6 样品的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 目的基因的鉴定结果
• 3.3.2 标准曲线的建立结果
• 3.3.3 实时荧光定量检测方法的复合率及敏感性试验
• 3.3.4 样品检测结果
• 3.4 讨论
• 4 实验三 马传染性贫血病毒受体选择性剪接变异体的真核表达及其功能研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞与病毒
• 4.1.2 质粒和血清
• 4.1.3 酶、试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 真核表达质粒的构建
• 4.2.3 真核表达质粒的提取和纯化
• 4.2.4 真核转染
• 4.2.5 间接免疫荧光检测目的蛋白在 293、Hela 细胞中的表达
• 4.2.6 Western-blot 检测目的蛋白在 293 细胞中的表达
• 4.2.7 稳定表达ELR1 及ELR1-IN 蛋白的293 细胞系的建立
• 4.2.8 RT-PCR 鉴定293-ELR1 和293-ELR1-IN 细胞系中目的基因的插入
• 4.2.9 病毒滴定实验确定病毒毒价
• 4.2.10 间接免疫荧光检测稳定表达 ELR1 蛋白的 293 细胞系对 EIAV 的敏感性
• 4.2.11 检测病毒载量的 Real-time RT-PCR 标准品的制备
• 4.2.12 在293-ELR1 和293-ELR1-IN 细胞上FDDV 病毒复制水平检测
• 4.2.13 可溶性受体对病毒感染细胞的影响
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组真核表达质粒的构建
• 4.3.2 间接免疫荧光检测各目的蛋白在细胞中表达结果
• 4.3.3 Western-blot 检测各目的蛋白在细胞中表达结果
• 4.3.4 RT-PCR 鉴定目的基因在293 细胞系的存在
• 4.3.5 间接免疫荧光检测ELR1 稳定转染的293 细胞系对EIAV 的敏感性
• 4.3.6 病毒滴定实验确定病毒的毒价结果
• 4.3.7 标准曲线的制作
• 4.3.8 实时定量RT-PCR 检测病毒在293-ELR1 及293－ELR1-IN 中的复制结果
• 4.3.9 Rt 酶活性检测病毒在 293-ELR1 及 293-ELR1-IN 中的复制
• 4.3.10 RT 酶活性检测可溶性受体对病毒感染细胞的影响
• 4.4 讨论
• 5 实验四 马传染性贫血病毒受体基因原核表达
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株与质粒
• 5.1.2 主要试剂及工具酶
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 引物设计
• 5.2.2 重组表达质粒的构建
• 5.2.3 重组表达质粒在 E.coli 中的表达及融合表达蛋白的分析
• 5.2.4 表达蛋白的纯化及 Western-blot 分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组表达质粒的构建
• 5.3.2 基因片段诱导表达结果
• 5.3.3 表达产物的 Western blot 检测
• 5.4 讨论
• 6 总体结论
• 7 本研究的创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介