深海细菌Aeromonas sp.HC11e-3 β-葡萄糖苷酶的克隆、表达，生化特性以及定点突变

论文摘要

p-葡萄糖苷酶可以广泛应用于多种工业领域,如在纤维素的降解中,辅助外切纤维素酶和内切纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖单糖；在食品工业中,水解果汁,茶汤中的芳香基糖苷类化合物,起到自然增香的效果；在医药工业中,水解中药活性成分的糖苷前体,制备有活性的中药成分；同时p-葡萄糖苷酶的转糖苷活性使得它在合成糖苷类活性物质上具有很好的应用前景,如利用p-葡萄糖苷酶合成表面活性剂烷基糖苷和益生元龙胆聚糖等。因此新的p-葡萄糖苷酶克隆与开发对于相应的工业应用领域具有重要意义。本研究从实验室库存的海洋细菌中,筛选得到一株高产β-葡萄糖苷酶的海洋气单胞菌Aeromonas sp. HClle-3。通过鸟枪法构建基因组文库,首次从该细菌中克隆得到一个p-葡萄糖苷酶基因,全长2382bp,编码793个氨基酸,将其命名为Bg1A。同源比对发现该酶隶属于糖苷水解酶第三家族,与来源于新阿波罗栖热袍菌Thermotoga neapolitana的同源性为45%,与其他已经报道生化特性的糖苷酶同源性不高于30%。将该酶基因克隆到pGEX-6p-1载体上,转化于大肠杆菌表达宿主中,利用IPTG诱导表达该酶,发现该酶在0.1mM的IPTG诱导剂,18度的培养温度下,在E.coli BL21（DE3）中表达良好。利用GST亲和纯化系统,纯化该酶,并测定其酶学性质,发现该酶在pH6.0和55℃条件下表现出最高活性。该酶特异性的水解芳香基糖苷,对人工合成的硝基酚葡萄糖苷,以及植物来源的葡萄糖苷七叶苷和熊果苷显示出最高的活性,对硝基酚木糖苷和硝基酚半乳糖苷也有微弱的活性。BglA有广泛的金属离子和化学试剂都具有很高的耐性。Ca2+, Mn2+, Zn2+, Ba2+, Pb2+, Sr2+对该酶有激活作用,SDS, EDTA, DTT对该酶有轻微的抑制。同时在0.5M的高葡萄糖浓度下,BglA仍表现出一定的活性,表明该酶有很强的葡萄糖耐受功能。总体来说,该酶是一个易于重组表达,同源性低,底物专一性强,对化学试剂耐受性强的p-葡萄糖苷酶。这些特性使得该葡萄糖苷酶能够被用在合适的工业领域。通过同源比对和结构模拟,推定该酶可能的活性位点为天冬氨酸288位和谷氨酸495位。利用重叠延伸定点突变技术将该酶的天冬氨酸288位和谷氨酸495位突变为丙氨酸,结果突变体D288A和E495A的活性分别降低820倍和4920倍,证实了Asp288和Glu495参与该酶的活性水解。这些结果为该家族其它葡萄糖苷酶活性位点的功能分析提供了一定的依据。

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Abstract

缩略语表

1. 前言

1.1 海洋微生物及其来源的酶类

1.2 β-葡萄糖苷酶及其作用底物

1.3 β-葡萄糖苷酶的生理功能

1.4 β-葡萄糖苷酶的分类

1.5 β-葡萄糖苷酶的作用机理

1.6 β-葡萄糖苷酶的应用

1.6.1 β-葡萄糖苷酶在生物能源工业中的应用

1.6.2 β-葡萄糖苷酶在食品工业中的应用

1.6.3 β-葡萄糖苷酶在中药工业上的应用

1.6.4 β-葡萄糖苷酶在合成功能糖苷类活性物质上的应用

1.7 微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆与特性研究

1.8 本研究的目的和意义

2. 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 溶液

2.1.5 仪器设备

2.2 方法

2.2.1 分子生物学常规操作

2.2.2 葡萄糖苷酶基因的克隆

2.2.3 葡萄糖苷酶酶学性质研究

3. 结果与分析

3.1 海洋细菌高活性β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选

3.2 海洋细菌Aeromonas sp.HC11e-3基因组文库的构建

3.2.1 海洋细菌总DNA的抽提

3.2.2 海洋细菌总DNA的酶切回收

3.2.3 海洋细菌基因组文库检测

3.2.4 β-葡萄糖苷酶阳性克隆子的筛选

3.4 β-葡萄糖苷酶序列的生物信息学分析

3.4.1 阳性克隆子DNA序列分析

3.4.2 β-葡萄糖苷酶基因的生物信息学预测

3.4.3 β-葡萄糖苷酶的氨基酸组成,等电点,信号肽,疏水性分析

3.4.4 β-葡萄糖苷酶的同源比对

3.5 β-葡萄糖苷酶基因的克隆

3.6 β-葡萄糖苷酶的重组表达纯化

3.6.1 β-葡萄糖苷酶的诱导表达纯化

3.6.2 β-葡萄糖苷酶的蛋白浓度测定

3.7 β-葡萄糖苷酶的酶学特性

3.7.1 β-葡萄糖苷酶的最适pH,最适温度及pH和温度稳定性

3.7.2 β-葡萄糖苷酶的动力学特性

3.7.3 β-葡萄糖苷酶的离子抑制特性

3.7.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性

3.7.5 薄层层析分析β-葡萄糖苷酶对纤维寡糖的水解能力

3.7.6 β-葡萄糖苷酶的时间水解特性

3.7.7 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受特性

3.8 β-葡萄糖苷酶的三维结构模拟及定点突变

3.8.1 β-葡萄糖苷酶结构域模拟

3.8.2 β-葡萄糖苷酶活性位点的三维结构功能分析

3.8.3 β-葡萄糖苷酶基因的重叠延伸突变

3.8.4 β-葡萄糖苷酶活性突变子的重组表达纯化

3.8.5 β-葡萄糖苷酶活性突变子的活性检测

4. 讨论

参考文献

致谢

附录葡萄糖苷酶的核苷酸序列及氨基酸序列

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