论文摘要
背景和目的脑血管病以其高发病率，高致残率，高死亡率而严重危害人类健康，已成为20世纪以来三大死亡原因之一。其中缺血性脑血管病，病因复杂，占脑血管病的70％-80％。近年来，脑血管病发病率仍呈上升趋势，神经保护剂正日益受到关注。神经保护剂适用人群范围广，能够弥补单纯溶栓治疗的不足，延长缺血细胞存活时间，对不能溶栓的患者也可起到减轻梗死体积，改善预后的作用，但到目前为止，临床上实际应用中有确切作用、价格低廉的药物还很少。因此，寻找适宜的神经保护剂仍是缺血性卒中迫切需要解决的问题之一。大量动物实验研究表明，脑缺血再灌注后神经元的死亡包括坏死和凋亡。自从1972年Kerr等人首先提出细胞凋亡的概念后，其逐渐引起人们的注意，已成为各学科研究的热点。研究发现，细胞凋亡的发生与许多基因表达有关，目前研究较多的为bcl-2基因家族、p53基因及半胱氨酸蛋白酶（caspases）家族。而bcl-2基因家族中又以bcl-2和bax研究的最多。bcl-2是一种抑凋亡基因，而bax则为促凋亡基因，Bcl-2／Bax的蛋白比例将决定细胞凋亡的程度。托吡酯（Topiramate，妥泰）是一种新型抗癫痫药，其化学结构与现有的抗癫痫药完全不同，属于自然态单糖右旋的硫化物，易于透过血脑屏障，作为广谱抗癫痫药，具有多方面的作用机制：（1）阻断电压依赖性Na+通道：阻断神经元持续性去极化反复诱发的动作电位；（2）增强GABA活性：托吡酯可提高GABA激活GABAA型受体的频率，加速Cl-进入细胞内，增强该抑制性神经递质的作用；（3）阻断AMPA（α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶哇-4-丙酸）／KA（红藻氨酸）谷氨酸受体：托吡酯可降低AMPA／KA受体引发的内向电流。最近的研究表明托吡酯对缺血再灌注大鼠具有脑保护作用，但托吡酯的脑保护作用机制尚未完全明了。本课题通过用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用托吡酯灌胃，光镜下观察脑缺血再灌注后海马CA1区损伤情况变化，应用TUNEL法检测海马CA1区凋亡细胞，并检测凋亡调节基因bcl-2、bax的表达，来探讨托吡酯的神经保护作用机制。为托吡酯作为脑保护药应用于临床提供理论依据。材料与方法（1）实验动物分组健康成年雄性SD大鼠72只，体重280～350g，随机分为1)假手术（A组） 24只2)缺血2h再灌注组（B组） 24只3)托吡酯干预，缺血2h再灌注组（C组） 24只A组又分为假手术2h后6h，12h，24h，48h四个组，每组6只。B、C组又各分为缺血2h再灌注6h，12h，24h，48h四个组，每组各6只。在造模前3天，C组大鼠按100 mg／kg托吡酯灌胃（用生理盐水制成混悬液2ml），每天一次；A组B组用等量生理盐水灌胃。（2）模型的制作第3天灌胃后半小时开始应用Zea-Longa线栓法制作缺血再灌注模型（MCAO），参照曹勇军，程彦斌报道的大鼠缺血再灌注模型制作方法。假手术组除不插线外，余同手术组。（3）标本的制作各组分别在缺血2h再灌注不同时间点处死大鼠，用4％的多聚甲醛灌注固定，取出脑组织，石蜡包埋备用。（4）观察指标：1)行为学评分：对所有造模成功的动物在缺血2h拔取线栓再灌注后不同时间点进行行为学评分；2)采用苏木素-伊红（HE）染色，甲苯胺蓝染色，观察大鼠脑海马神经元变化情况，免疫组化SP法观察Bcl-2，Bax的表达，TUNEL法观察大鼠海马神经元凋亡情况。（5）统计方法：应用SPSS11.5统计软件进行数据处理，实验测定数据用均数±标准差（（?）±s）表示。两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较，采用单因素方差分析。以α=0.05作为检验水准。结果（1）一般情况：术后各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、饮食差、自洁能力下降、反应迟钝，其中，B组、C组行动迟缓，右侧肌力下降，提尾右上肢不能伸展，行走时出现旋转、追尾或向右侧倾倒现象；（2）行为学评分：A组行为学评分均为0分。C组行为学评分在各时间点皆比B组低。B组与C组大鼠比较各时间点差异均有统计学意义（P＜0.05）。特别是再灌注48h，B组：1.50±0.22，C组：0.50±0.55（P＜0.01）；（3）各组苏木素伊红（HE）染色观察：①A组海马神经细胞结构紧密，层次清晰，细胞数量较多。②B组海马神经细胞层次不清，排列疏松，数量减少，胞体皱缩变性呈三角形，核固缩、碎裂或溶解，部分神经元空泡变性。神经元同周围组织间隙增宽。③C组海马神经细胞和B组相比：层次较清，细胞数较多，核固缩、碎裂或溶解细胞较少，空泡变性神经元较少。但C组和A组相比细胞仍有不同程度的缺失；（4）甲苯胺蓝染色观察：①A组海马神经细胞层次清，排列紧密，核大而圆，胞浆内尼氏体丰富，胞浆与胞核清晰可辨。②B组海马神经细胞层次减少，排列稀疏，胞浆内尼氏体消失，胞浆与胞核结构不清。③C组海马神经细胞和B组相比：层次较多，细胞数目较多，胞浆内尼氏体消失的细胞数目较少；（5）Bcl-2免疫组化染色：A组，Bcl-2阳性细胞在各时间点海马神经元中可见微弱表达，但明显少于B、C组（P＜0.01）。C组与B组相比，C组各时间点海马Bcl-2阳性细胞数高于B组（P＜0.05）。Bcl-2阳性细胞数在再灌注6h：A组4.67±1.03，B组27.67±1.63，C组30.67±1.21。12h：A组5.17±0.98，B组43.33±2.16，C组50.17±2.32。24h：A组6.00±1.55，B组30.00±2.67，C组48.67±1.63。48h：A组5.33±1.03，B组12.67±1.86，C组30.50±1.87；（6）Bax免疫组化染色：A组，Bax阳性细胞在各时间点海马神经元中皆有极微弱表达，但少于B、C组（P＜0.05）。B组、C组相比，C组各时间点海马Bax阳性细胞数少于B组（P＜0.05）。Bax各组阳性细胞数在再灌注6h：A组5.00±1.26，B组21.50±1.87，C组14.83+2.71。12h：A组4.83±1.17，B组33.17±1.94，C组25.33±3.0。24h：A组4.83±1.17，B组32.6±1.86，C组20.50±2.17。48h，A组4.00±1.10，B组18.17±0.75，C组12.50±2.43；（7）TUNEL标记结果：A组，偶见凋亡细胞。B、C组可见大量凋亡细胞，B、C组相比，C组各时间点海马凋亡细胞数少于B组（P＜0.05）。凋亡细胞数在再灌注6h：B组9.50±1.87，C组7.00±1.79。12h：B组13.67±2.16，C组9.17±1.47。24h：B组17.17±2.23，C组11.17±1.67。48h：B组20.00±1.41，C组13.33±1.68。结论（1）托吡酯可以降低缺血再灌注大鼠瘫痪后行为学评分，减轻神经缺损症状。（2）托吡酯可以通过提高Bcl-2表达，降低Bax表达，使缺血再灌注大鼠海马凋亡细胞减少，对大鼠起到脑保护作用。