脾阴虚相关肠道菌的鉴定及作用

论文摘要

脾虚证是临床常见的中医证候之一,主要是以消化系统为主的多系统多器官的功能低下。脾阴虚证是脾虚证众多证型中的一种,多为内伤气血所致,进而导致机体各脏器间的平衡遭到破坏,最终导致菌群失调。本课题从大鼠粪便中直接提取肠道菌群总DNA,用ERIC及16S rDNA引物对其进行扩增,检测肠道菌群的总体存在及变化情况,分别建立在一定条件下健康动物肠道菌群ERIC-PCR及16S rDNA-RFLP的指纹图谱;采用番泻叶水煎剂加甲状腺素建立脾阴虚证动物模型,比较模型动物与健康动物的肠道菌群的变化,得到脾阴虚证模型动物的基因组指纹图谱,确定脾阴虚证相关分子生物学指标,包括ERIC-PCR特征条带340bp的净面积、丰度及菌群相似性指数;16S rDNA-RFLP HaeⅢ/HinfⅠ酶切图谱特征条带460bp/360bp的丰度及菌群相似性指数。采用所建立的分子指标分别比较四君子汤、理中汤、补中益气汤及益胃汤四种方剂对脾阴虚证的治疗作用,结果显示四君子汤、理中汤、补中益气汤中剂量疗效较好,而益胃汤并无明显治疗作用。为进一步确定与脾阴虚证相关的菌群,分别对3个特征条带（340bp、460bp和360bp）进行克隆鉴定,并探讨其相关生理作用。肠道菌群的基因指纹图谱能较全面的反映肠道菌群的整体变化状况,具有同期性。本课题通过采用ERIC-PCR及16S rDNA-RFLP技术对脾阴虚大鼠肠道菌群变化进行的研究,体现出现代生物技术与传统中药的研究相结合的理论和应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 脾阴虚证
• 1.1 脾阴及脾阴虚
• 1.2 脾阴虚证动物模型
• 2 肠道微生物的研究进展
• 2.1 肠道微生物及其作用
• 2.2 益生菌及微生态制剂
• 2.3 肠道菌群与中药代谢
• 3 肠道菌群的研究方法
• 3.1 传统的纯培养方法
• 3.2 分子生物学方法
• 4 课题意义与研究内容
• 第二章 脾阴虚证大鼠模型的建立和治疗
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 药材
• 2 方法
• 2.1 试剂配制
• 2.2 模型的建立与反证治疗
• 2.3 大鼠粪便样品的收集
• 2.4 数据分析
• 3 结果
• 3.1 一般体征观察
• 3.2 大鼠体重变化情况
• 4 结论与讨论
• 第三章 大鼠肠道菌群总DNA的提取
• 1 材料
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 DNA提取方法
• 2.2 总DNA质量检测
• 3 结果
• 4 结论与讨论
• 第四章 脾阴虚证模型ERIC-PCR分子指标的建立
• 1 材料
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 ERIC-PCR反应
• 2.2 PCR产物检测
• 2.3 数据分析
• 3 结果
• 3.1 脾阴虚证模型大鼠ERIC-PCR特征条带的确定
• 3.2 特征条带净面积和丰度
• 3.3 ERIC-PCR指纹图谱的相似性系数
• 3.4 四种复方对脾阴虚证模型的疗效（ERIC-PCR指纹图谱分析法）
• 4 结论与讨论
• 第五章 脾阴虚证模型16S rDNA-RFLP分子指标的建立
• 1 材料
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 试剂的配制
• 2.2 16S rDNA扩增反应
• 2.3 16S rDNA产物电泳检测
• 2.4 16SrDNA产物的纯化及酶切反应
• 2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显色
• 2.6 数据分析
• 3 结果
• 3.1 16SrDNA-RFLP HaeⅢ酶切指纹图谱评价指标的建立
• 3.2 16S rDNA-RFLP HinfⅠ酶切指纹图谱评价指标的建立
• 4 结论与讨论
• 第六章 脾阴虚大鼠肠道菌群分子指标的测序分析
• 1 材料
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 样品的扩增
• 2.2 片段回收及检验
• 2.3 产物加尾和纯化
• 2.4 克隆的连接反应
• 2.5 热激转化
• 2.6 PCR鉴定
• 2.7 测序和结果分析
• 3 结果
• 3.1 脾阴虚模型ERIC-PCR特征条带340bp
• 3.2 脾阴虚模型16S rDNA-RFLP HaeⅢ酶切特征条带460bp
• 3.3 脾阴虚模型16S rDNA-RFLP HinfⅠ酶切特征条带360bp
• 4 结论与讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢