全人源抗c-Met Fab抗体的筛选及鉴定

论文摘要

c-Met是由原癌基因Met编码的酪氨酸激酶受体,位于细胞膜上,包含1个50kDa的α亚基和1个150kDa的β亚基,两者经二硫键连接形成异二聚体。c-Met是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor/scatterfactor,HGF/SF）在体内的唯一受体,两者结合并随之激活后可促进肿瘤细胞的增殖、迁徙和新血管生成,最终导致恶性肿瘤的侵袭和转移。目前HGF/SF和c-Met多种拮抗剂的研究已在体外和动物实验中证明可有效地抑制肿瘤的发生、侵袭和转移,HGF/SF-c-Met已经成为肿瘤诊断和生物治疗的新靶点。鼠源抗HGF/SF和c-Met单克隆抗体和/或多克隆抗体已在体外和动物实验中显示出高亲和力和中和活性,但是鼠源性单克隆抗体引起的人抗鼠抗体反应（human antimouse antibody,HAMA）限制了鼠源抗体在临床中的应用。这就推动了人源化单克隆抗体的研究。与鼠源性单克隆抗体相比,人源化单克隆抗体免疫源性明显减弱,并且血清半衰期显著延长,促进了单克隆抗体在临床中的应用。本文利用固相筛选方法从大容量人源天然Fab抗体库中筛选抗c-Met Fab抗体,并对其与人肝癌细胞的结合活性进行鉴定,为研制用于肝癌生物治疗的靶向药物,提供候选分子。材料与方法1.以Met-Fc融合蛋白包板,扩增本实验室制备的大容量人源天然Fab抗体库（库容为1.2×109）。将噬菌体抗体加入Met-Fc包被的ELISA板,进行6轮洗脱、富集,从第6轮筛选后得到的细菌集落中随机挑取60个克隆,分别用Met-Fc、IgG包板,用Phage ELISA方法鉴定它们的免疫学特性。2.可溶性表达:用符合条件（Met-Fc（+）、IgG（-））的细菌克隆质粒转染Top 10F’,经IPTG诱导表达抗c-Met Fab抗体。诱导表达上清通过Protein L亲和层析法纯化。3.用Western blotting、IP、FACS、免疫荧光等方法鉴定抗c-Met Fab抗体与c-Met表达阳性细胞表面c-Met分子的结合活性。结果1.用Met（c-28）兔抗Met多克隆抗体鉴定SMMC7721、BEL7402两株肝癌细胞,结果显示c-Met均表达于肝癌细胞表面。2.经过6轮Met-Fc固相筛选的噬菌体感染XL I-Blue大肠杆菌,随机挑取60个克隆表达,进行Phage ELISA鉴定。其中54个克隆与Met-Fc呈阳性反应,阳性率为90%。54个克隆中与Fc呈阴性反应者有4个克隆（AM1-14、AM2-9、AM2-18、AM2-26）,BstOI酶切鉴定显示为同一克隆,测序结果显示为人Fab片段。3.阳性克隆经IPTG诱导表达,诱导表达上清经Protein L亲和层析纯化得到抗c-Met Fab抗体,经SDS-PAGE电泳,在相对分子量26、34kDa处各出现一条条带,经Western blotting检测为人Fab片段。4.IP、FACS、免疫荧光结果显示AM2-26可与SMMC7721、BEL7402细胞表面c-Met分子结合。结论从大容量天然人源Fab抗体库中筛选的AM2-26能够与肝癌细胞表面c-Met分子特异性结合,为研制用于肝癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 全人源抗c-Met Fab抗体的筛选
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 全人源抗c-Met Fab抗体与肝癌细胞结合活性的分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录1:综述
• 参考文献
• 附录2:中英文名词对照
• 致谢