谢氏丙酸菌维生素B12生物合成核糖开关敲除的功能研究

论文摘要

核糖开关（Riboswitch）是高度结构化的遗传控制元件。是mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象,这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子,从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的。核糖开关结合代谢物配体,能感知各种过量的代谢物,从而抑制相关基因的表达。本研究拟通过基因敲除技术,破坏谢氏丙酸菌维生素B12生物合成的核糖开关对相应基因的抑制作用,以期提高维生素B12产量。首先完成维生素B12生物合成cbiB基因及P138启动子片段克隆,构建维生素B12生物合成核糖开关敲除载体,并转化至野生型谢氏丙酸菌中,将野生型谢氏丙酸菌（Propionibacteria. shermanii）基因组中核糖开关敲除,进而达到提高维生素B12在谢氏丙酸菌中的产量,主要研究结果如下：（1）利用PCR技术成功完成维生素B12生物合成cbiB基因及P138启动子片段的克隆和两基因的融合,并连接到载体pMD18-T上,构建了克隆载体pT-PCB。（2）通过酶切酶连的方法将来自于红色糖多孢菌（Saccharopolyspora ery thraea）的ermE基因克隆至pT-PB载体中,建了维生素B12生物合成基因-cbiB基因核糖开关基因敲除整合载体pT-PCBE。（3）将构建好的维生素B12生物合成核糖开关敲除载体pT-PCBE转化至野生型谢氏丙酸菌中,通过对红霉素筛选得到的转化子进行PCR验证,证实了核糖开关敲除载体与丙酸菌野生型基因组发生了同源重组。（4）在相同培养和发酵条件下,利用谢氏丙酸菌维生素B12生物合成核糖开关敲除基因工程菌和野生型谢氏丙酸菌进行发酵,并通过液相色谱技术定量测定单位质量内的维生素B12的含量。核糖开关基因敲除工程菌的维生素B12的产量相对于野生型谢氏丙酸菌并没有提高。说明单纯敲除cbiB上游的核糖开关未促进维生素B12的生物合成,表明维生素B12生物合成还受到其它因子的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 12生物合成及其调控研究进展'>1.1 维生素B₁₂生物合成及其调控研究进展
• 12发现、结构及功能简介'>1.1.1 维生素B₁₂发现、结构及功能简介
• 12生物合成'>1.1.2 维生素B₁₂生物合成
• 12生物合成的调控'>1.2 维生素B₁₂生物合成的调控
• 12生物合成的基因工程'>1.3 关于维生素B₁₂生物合成的基因工程
• 12合成相关基因'>1.3.1 维生素B₁₂合成相关基因
• 12基因工程现状'>1.3.2 维生素B₁₂基因工程现状
• 1.4 基因敲除技术简介及研究进展
• 1.4.1 基因敲除的概念及原理
• 1.4.2 基因敲除技术在微生物育种中的应用
• 12生物合成cbiB基因及P138启动子克隆'>第2章 维生素B₁₂生物合成cbiB基因及P138启动子克隆
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 质粒及菌株
• 2.2.2 常用生化试剂及酶
• 2.2.3 实验仪器
• 2.3 生化试剂及培养基配制
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 大肠杆菌感受态制备及转化
• 2.4.2 质粒提取
• 2.4.3 PCR操作方法
• 2.4.4 琼脂凝胶电泳
• 2.4.5 DNA纯化
• 2.5 P138-cbiB融合基因PCR实验步骤
• 2.5.1 P138启动子基因克隆
• 2.5.2 P138-cbiB融合基因PCR
• 2.6 结果与分析
• 2.6.1 P138启动子与cbiB基因PCR扩增结果
• 2.6.2 P138-cbiB融合基因PCR结果
• 2.7 小结
• 12生物合成核糖开关敲除载体的构建'>第3章 维生素B₁₂生物合成核糖开关敲除载体的构建
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 质粒及菌株
• 3.2.2 常用生化试剂及酶
• 3.2.3 试剂及仪器
• 3.2.4 生化试剂及培养基配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 DNA的酶切与连接
• 3.3.2 提取基因组DNA
• 3.3.3 利用DNA Polymerase克隆ermE基因PCR
• 3.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 3.3.5 质粒提取及凝胶电泳鉴定
• 12生物合成核糖开关敲除载体的技术流程'>3.4 构建维生素B₁₂生物合成核糖开关敲除载体的技术流程
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 ermE基因扩增结果
• 3.5.2 质粒pT-PCB酶切结果
• 3.5.3 阳性克隆质粒pT-PCBE的PCR验证结果
• 3.6 小结
• 第4章 基因工程菌的构建及鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 质粒及菌株
• 4.2.2 常用生化试剂及酶
• 4.2.3 试剂及仪器
• 4.2.4 培养基及生化试剂配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 野生型谢氏丙酸菌的培养及感受态制备
• 4.3.2 转化及筛选方法
• 4.4 实验路线
• 4.5 实验结果
• 4.5.1 电转化结果
• 4.5.2 阳性克隆的PCR筛选结果
• 4.6 小结
• 12的发酵'>第5章 维生素B₁₂的发酵
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 菌体湿重的测定
• 5.3.2 培养方法
• 5.3.3 酵液样品的制备
• 5.3.4 标准样品溶液的制备
• 5.3.5 色谱操作条件
• 12发酵'>5.4 维生素B₁₂发酵
• 5.5 实验结果与讨论
• 5.5.1 检测波长的确定
• 5.5.2 线性关系
• 5.5.3 样品测定
• 5.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢