圆弧青霉碱性脂肪酶基因的克隆、定点突变及其表达的研究

论文摘要

本论文以圆弧青霉BD26（Penicillium cyclopium BD26）为出发菌株,采用RT-PCR扩增出编码脂肪酶的774bp成熟肽基因片段。序列测定结果表明,该序列与圆弧青霉基因序列（GenBank登录号:AF274320）和扩展青霉脂肪酶基因序列（GenBank登录号:AAG22769）同源性高达99%。脂肪酶基因Lip PD克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a、pET-25b和pTrc99a,构建重组工程菌BL21/pET-28a-Lip PD、BL21/pTrc99a-Lip PD和BL21/pET-25b-Lip PD。三种重组菌体在固体琼脂显色平板上都形成了明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示,在三种宿主菌中都含有分子量约为27 kDa的活性脂肪酶蛋白。对工程菌BL21/pTrc99a-Lip PD表达条件优化结果表明:该脂肪酶在pTrc99a原核表达系统中,培养至OD600为0.8时,加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,在37℃诱导培养2h后比酶活为11.74U/mg。对工程菌BL21/pET-28a-Lip PD表达条件优化结果表明:该脂肪酶在pET原核表达系统中,培养至OD600为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L ,在32℃诱导培养1h比酶活达29.30U/mg。工程菌BL21/pET-25b-Lip PD周质溶液经NaOH滴定法测定,比酶活为24.19U/mg。经定点突变证明,S132、D188和H241的确为Lip PD的三联体催化活性中心。LipG24C的最适反应温度仍为25℃,比酶活是20.73U/mg,为野生型的85.71%。LipA252C的最适反应温度为30℃,与原酶相比提高了5℃,比酶活为34.59U/mg,是野生型的1.43倍。将该酶成熟肽基因片段克隆入酵母表达载体pPIC9K中,电转化毕赤酵母宿主GS115。经过抗性和表型筛选,从抗性为3.00mg/mL G418的平板上挑选15株重组工程菌GS115/pPIC9k-LipPD,在其发酵上清液中没有检测到酶活,而在其胞内检测到了脂肪酶酶活,仅为10.53U/mg。SDS-PAGE电泳显示,重组蛋白在宿主菌GS115中表达量不高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶概述
• 1.2 脂肪酶的来源及产脂肪酶微生物的选育
• 1.3 脂肪酶的结构
• 1.3.1 脂肪酶的一级结构
• 1.3.2 脂肪酶的二级结构
• 1.3.3 脂肪酶的三级结构
• 1.4 脂肪酶的催化机理
• 1.4.1 重叠延伸PCR 酶与底物的结合
• 1.4.2 四面体中间复合物的形成
• 1.4.3 酰基－酶共价中间体复合物的形成
• 1.4.4 脱酰基过程
• 1.5 立题依据
• 1.6 研究目的及内容
• 第二章 脂肪酶基因的克隆和序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 化学试剂
• 2.2.3 质粒与菌株
• 2.2.4 溶液配制
• 2.2.5 PCR 引物
• 2.2.6 培养基
• 2.2.7 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 圆弧青霉总RNA 提取
• 2.3.2 脂肪酶基因cDNA 片段的RT-PCR 扩增及序列测定
• 2.3.3 PCR 产物的克隆、鉴定
• 2.3.4 圆弧青霉脂肪酶cDNA 序列分析
• 2.3.5 圆弧青霉脂肪酶三维模型预测
• 2.4 小结
• 第三章 脂肪酶基因在大肠杆菌细胞质和细胞周质中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 主要仪器和试剂
• 3.2.2 质粒与菌株
• 3.2.3 PCR 引物
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 三种重组质粒的鉴定
• 3.3.2 BL21/pTrc99a-Lip PD 表达产物的鉴定及表达条件的优化
• 3.3.3 BL21/pET-28a-Lip PD 表达产物的鉴定及表达条件的优化
• 3.3.4 BL21/pET-25b-Lip PD 表达产物的鉴定
• 3.4 小结
• 第四章 脂肪酶基因的定点突变
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要仪器和试剂
• 4.2.2 质粒与菌株
• 4.2.3 PCR 引物
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 突变基因的获得
• 4.3.2 重组工程菌的构建
• 4.3.3 表达产物的鉴定
• 4.3.4 LipG24C 和LipA252C 最适反应温度研究
• 4.4 小结
• 第五章 脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验仪器
• 5.2.2 材料
• 5.2.3 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 毕赤酵母重组表达质粒的构建
• 5.3.2 重组毕赤酵母的平板筛选
• 5.3.3 PCR 检测转化子
• 5.3.4 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达及产物检测
• 5.4 小结
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录