木质素合成调控及其与甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性关系研究

论文摘要

菌核病和倒伏是影响我国油菜生产的两个重要因素,不仅严重降低了油菜的产量,同时也影响了菜籽的品质和收获指数。在生产中这两个因素又表现出相互促进的作用,因而给油菜生产带来了更大的危害。栽培措施的改进和化学农药的使用虽然可以缓减这些因素的影响,但效果有限,且化学农药还会造成环境污染。传统育种和转OXO、几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因等虽然可以在一定程度上提高油菜抗菌核病的能力,但由于缺乏有效的抗源材料,油菜抗菌核病育种一直未取得实质性进展。而国内外对作物抗倒伏性研究也仅处于描述性研究阶段。因此,探索新的方法以提高油菜及其它作物的抗病性和抗倒伏性具有重要的意义。 木质素作为植物机械组织和细胞壁的重要组成部分,对于增强植物抵御各种逆境（风、雨、病原菌）的能力具有重要的作用。在木质素生物合成途径中,4-香豆酰CoA连接酶（4-coumaryl:CoA ligase,4-CL）处于代谢分支点的位置,引导着光合代谢产物向木质素合成途径的流动,被认为是调控木质素合成的理想靶基因。本文首先分析了不同油菜材料木质素含量及其与油菜抗菌核病和抗倒伏性之间的相关关系,为利用基因工程技术提高油菜木质素含量,增强其抗菌核病和抗倒伏能力提供依据。利用同源序列法从毛白杨中分离4-CL基因,并对其生化功能进行验证,进而通过异源4-CL基因在甘蓝型油菜（Brassica napus）中的过量表达,研究4-CL活性水平的调控对油菜木质素含量及抗菌核病和抗倒伏能力的影响,为油菜高产、优质、抗逆育种奠定基础,并为作物抗病和抗倒伏研究及育种提供新的思路和方法。本文的另一个研究内容是选用特异抗菌核病、抗倒伏和特异不抗菌核病、不抗倒伏的油菜材料配制杂交组合,利用共显性标记SSR和基于功能基因外显子的SRAP标记对甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性进行QTL定位研究,筛选对油菜抗菌核病和抗倒伏性状具有显著作用的QTL位点,为下一步QTLs的分离和基因聚合创造条件。本研究获得主要如下结果: 1.分析了29个油菜材料茎杆木质素含量与抗菌核病和茎杆强度之间的相关关系,其相关系数分别为0.6971和0.618,表明木质素含量与油菜抗菌核病和抗倒伏之间存在显著正相关性。 2.从毛白杨木质化茎中分离了一个4-CL cDNA,序列分析表明,该cDNA包含翻译起始密码子和终止密码子及完整的编码框序列（ORF）。推导氨基酸序列分析表明,该cDNA编码蛋白序列中包含所有已知4-CL蛋白的两个特征序列boxⅠ（SSGTTGLPKGV）和boxⅡ（GEICIRG）。进化分析表明,该蛋白为class Ⅰ 4-CL蛋白,且在进化上与白杨（Populus tremuloides）中参与木质素合成的4-CL1（AF041049）最为相近。 3.构建了原核表达载体pETL,利用E.coli表达了含N-末端多聚组氨酸（His×6）标签的4-CL重组蛋白。活性分析表明,所表达的重组蛋白具有生物学活性,能够催化参与木质素合成的三种底物PA、CA、FA的活化,底物偏爱性顺序为PA>FA>CA。重组蛋白对SA则没有活性。 4.利用Ni2+亲和柱纯化了带His×6标签的4-CL重组蛋白,以纯化蛋白作为抗原,制备4-CL抗血清,为下一步转基因植株的Western blotting检测奠定基础。 5.构建了植物表达载体pBI121:4CL和pBI-C4H:4CL,并转化甘蓝型油菜品种中双9号和37301,共获得56棵抗Kan转基因植株,其中51株来自37301,包括转pBI121:4CL植株12棵和转

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 油菜抗菌核病研究进展
• 1.1.1 菌核病的致病方式
• 1.1.2 作物的抗病机制
• 1.1.3 作物抗菌核病育种
• 1.2 作物抗倒伏研究进展
• 1.3 木质素合成及其调控研究进展
• 1.3.1 木质素的类型与分布
• 1.3.2 木质素的生物合成
• 1.3.3 木质素合成的分子调控
• 1.3.4 木质素与作物抗病和抗倒伏性的关系
• 1.4 4-香豆酰CoA连接酶（4-CL）研究进展
• 1.4.1 4-CL的组成、结构及酶学研究
• 1.4.2 4-CL在植物基因工程中的应用
• 1.5 分子标记技术及油菜重要农艺性状QTL定位研究进展
• 1.5.1 分子标记技术
• 1.5.2 数量性状基因座（QTL）分析
• 1.5.3 油菜重要性状基因定位研究
• 1.5.4 油菜QTL定位应用研究
• 1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 木质素含量与油菜抗菌核病和抗倒伏性相关关系分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 第三章 毛白杨4-CL cDNA的克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 4-CL cDNA的扩增及序列分析
• 3.2.2 进化分析
• 3.3 讨论
• 第四章 4-CL基因的表达、活性分析和多克隆抗体制备
• 4.1 原核表达载体的构建
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 21（DE₃）中的表达'>4.2 4-CL观基因在BL₂₁（DE₃）中的表达
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 4-CL重组蛋白活性分析
• 4.3.1 材料
• 4.3.2 方法
• 4.4 4-CL多克隆抗体的制备
• 4.4.1 材料
• 4.4.2 方法
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 原核表达载体的构建
• 4.5.2 4-CL基因在BL21（DE3）中的诱导表达
• 4.5.3 4-CL重组蛋白活性分析
• 4.5.4 4-CL多克隆抗体的制备
• 4.6 讨论
• 第五章 4-CL基因在甘蓝型油菜中的转化
• 5.1 植物表达载体pBI121：4CL和pBI-C4H：4CL的构建
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 甘蓝型油菜的转化
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 转基因油菜的分子生物学鉴定
• 5.3.1 材料
• 5.3.2 方法
• 5.4 转基因油菜木质素含量及抗菌核病和茎杆强度的测定
• 5.4.1 材料
• 5.4.2 方法
• 5.5 结果与分析
• 5.5.1 C4H启动子的扩增及测序
• 5.5.2 植物表达载体pBI121：4CL和pBI-C4H：4CL的构建
• 5.5.3 甘蓝型油菜的转化及Kan抗性苗的获得
• 5.5.4 转基因油菜PCR检测
• 5.5.5 转基因油菜Southern blottiong检测
• 5.5.6 转基因油菜Western blottiong检测
• 5.5.7 转基因油菜木质素含量分析
• 5.5.8 转基因油菜抗菌核病和茎杆强度的测定
• 5.6 讨论
• 第六章 甘蓝型油菜抗菌核病QTL定位分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 2：3群体的构建'>6.2.1 F_2：3群体的构建
• 6.2.2 亲本多态性检测
• 6.2.3 DNA标记的分离分析
• 6.2.4 连锁遗传图谱的构建
• 3家系群体中的表现及变异分析'>6.2.5 油菜菌核病抗性在F₃家系群体中的表现及变异分析
• 6.2.6 油菜抗菌核病的QTL定位及其效应分析
• 6.3 讨论
• 第七章 讨论与总结
• 7.1 讨论
• 7.1.1 木质素在油菜抗菌核病和抗倒伏机制中的作用
• 7.1.2 木质素的合成调控
• 7.2 小节
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历