拟南芥中两种动蛋白异型体KatB/KatC生化性质及组织分布研究

论文题目: 拟南芥中两种动蛋白异型体KatB/KatC生化性质及组织分布研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 姜世玲

导师: 刘国琴,任东涛

关键词: 微管,共沉淀,同源二聚体,异源二聚体,突变体

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 动蛋白是一类依赖于微管的马达蛋白,它能利用ATP水解产生的能量沿微管运动。动蛋白具有依赖于核苷酸的微管结合特性和被微管激活的ATPase特性,这两个特性由动蛋白的头部马达区负责。动蛋白组成一个庞大的动蛋白超家族,广泛存在真核细胞,参与了众多的生物学过程,如细胞器运输、有丝分裂和减数分裂、微管的动态调节以及信号转导等。拟南芥中存在着61个动蛋白异型体。KatB和KatC是于1993年从拟南芥中最早克隆出的五个动蛋白基因中的两个,属于C端马达蛋白,它们所编码蛋白质的氨基酸同源性高达84%。虽然其基因很早就被克隆,但有关二者的生物化学特性和功能报道很少。深入研究KatB和KatC的体外生物化学特性和体内组织分布规律,对揭示植物动蛋白异型体的功能作用具有重要的理论意义。 本研究利用KatC的N-端尾部区域(128aa)的cDNA序列构建了原核表达载体,并在大肠杆凶中进行表达、纯化。与微管的共沉淀实验表明,KatC N-端尾部区域能与微管结合,而且这种结合不依赖于ATP。冷CCD荧光显微观察结果表明,KatC N-端尾部区域不能引起微管的成束。为了确定负责与微管结合的最小区域,我们构建了6段不同长度的原核表达载体,并进行了表达、纯化;纯化的各删除片段用来与微管进行共沉淀分析。结果表明,KatC N端尾部区域的第74-86aa肽段是负责与微管结合的区域,而且包含此区域的不同删除片段与微管的结合比不同,说明这一微管结合位点可能是构象依赖型的。点突变实验结果进一步表明,Arg77和Arg79在KatC的N-端尾部区域与微管结合的过程中起着关键性的作用。同时,我们构建、表达、纯化了KatB的除去马达区的385个氨基酸的片段,其与微管的共沉淀实验表明,KatB在尾部区域同样也存在着第二个微管结合位点。 将含有KatB、KatC杆区的KatB(1-383aa)和KatC(1-394aa)区段分别融合His、GST,各产生了两种带不同标签的融合蛋白,通过Pull down实验研究KatB、KatC各自及二者的相互作用。实验结果表明,KatB、KatC不但各自可以自己相互作用,形成同源二聚体,二者也可以相互作用形成异源二聚体。 用gus作为报告基因,对KatB和KatC启动子驱动的gus活性进行比较。结果表明:(1) KatB和KatC启动子在根部都有活性,但具体部位不同。KatC启动子的活性主要集中在根尖分生区及幼嫩的根毛中。而KatB启动子除了在分生区有活性外,在中柱内及不同发育时期的侧根内都有较强的活性。(2) KatB启动子驱动的gus在叶原基、叶脉、叶毛、花药、果荚中都有活性,但KatC启动子驱动的gus却只在果荚中有活性。 为了进—步了解KatB、KatC在植物体内的分布,我们分别选用KatB特异肽段(CAHRHVNARPLDY)及KatC的特异肽段(CPRRQTNIKPLEN)为抗原,制备抗血清。经亲和纯化的抗体能够特异地识别KatB、KatC而无免疫交叉反应。用免疫印迹对KatB、KatC在拟南芥中的组织分布进行了研究,结果表明:KatB在拟南芥中,除了果荚外,在幼苗、根、茎、叶和花中都有表达,但KatC在叶和花中表达很弱,却在果荚里表达较强。

论文目录:

1 文献综述—动蛋白研究进展

1.1 动蛋白的生化性质

1.2 动蛋白的结构

1.3 动蛋白超家族的分类、命名与系统进化树

1.4 动蛋白的功能

1.5 高等植物中的动蛋白

1.6 拟南芥中的动蛋白研究

1.7 本研究的目的和意义

2 KatB／KatC的体外生化性质

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

3 KatB／KatC的体内组织分布

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

4 KatB／KatCT-DNA单插入突变体及双突变体的获得及表型的初步观察

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

总结

参考文献

致谢

发布时间: 2006-04-05

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