论文摘要
背景与目的：慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。第9号与第22号染色体相互易位形成的Ph染色体是CML的肿瘤恶性克隆标志。这种染色体平衡易位导致9q34上的c-Abl原癌基因与22q11上的Bcr（breakpoint cluster region）基因断裂后并置，形成新的融合基因Bcr-Abl，后者编码的P210Bcr-Abl蛋白具有持续激活的蛋白酪氨酸激酶（proteintyrosine kinase，PTK）活性。P210Bcr-Abl蛋白通过催化其自身和底物蛋白上特定位点的酪氨酸残基过度磷酸化，导致多条信号传导通路异常，从而引起细胞增殖过度、分化受抑、凋亡减少、黏附性异常。因此，Bcr-Abl被认为是CML发病的根本原因及治疗靶点。P210Bcr-Abl蛋白的竞争性抑制剂伊马替尼使CML的治疗取得了重大突破。2006年IRIS（Intemational Randomized Study of Interferon VS STl571）研究报道，初诊慢性期（chronic phase,CP）CML患者经伊马替尼治疗5年后，约7％进展至加速期（advanced phase,AP）或急变期（blast crisis,BC），CML相关死亡率仅5％。虽然伊马替尼在CP-CML的治疗中获得了显著的疗效，但相当一部分患者，尤其是AP和BC患者出现了原发或继发性耐药。伊马替尼耐药的机制是复杂的，主要包括以下五点：1、Abl激酶区基因的点突变；2、Bcr／Abl基因扩增及表达增加；3、MDR-1基因的高表达；4、α1-酸性糖蛋白作用；5、其它蛋白激酶（如SRC激酶家族成员LYN、Hck等）异常激活等。目前认为，Abl激酶区基因点突变所致的P210Bcr-Abl蛋白激酶重新激活是引起耐药的重要原因，在耐药患者中的检出率为30％-90％。2006年GIMEMA工作组对370例CML患者的点突变分析发现，AP、急性髓系变和急性淋系变患者点突变率分别为52％、75％和83％。已检测到的突变类型有70多种，涉及50余种氨基酸的改变，可发生在P-环、A-环、催化区或两者之间的接触位点（如T315，F317）。其中P-环、T315I和M351T／V突变最常见，发生率约为60％-85％。点突变引起Abl激酶氨基酸的改变，通过直接阻断伊马替尼与Abl激酶的结合或者防碍Abl激酶失活构象的形成，干扰药物与靶位点的结合，最终导致耐药的发生。此外，不同点突变还可通过改变P210Bcr-Abl蛋白的生物学特性和转化的潜能，影响预后。部分耐药患者，即使利用高敏感检测手段，如等位基因特异性寡核苷酸聚合酶链式反应（ASO-PCR），仍不能检测到点突变。对于该类患者，可能存在基因扩增、转录增强、MDR基因高表达等其它因素导致P210Bcr-Abl蛋白再激活，或其它蛋白激酶异常激活引起的非P210Bcr-Abl蛋白依赖性机制。Bcr-Abl融合基因转录水平增高也是伊马替尼耐药的主要机制。在疾病复发前融合基因转录水平呈上升趋势。因此，监测CML患者在伊马替尼治疗过程中体内Bcr-Abl转录水平的变化，可以使临床医师在血液学或细胞遗传学复发前进行早期预测，及时采取治疗干预，如提高药物剂量或应用其它分子靶向抑制剂，可以逆转部分患者的疾病进展或耐药。此外，Bcr-Abl融合基因表达水平的下降程度是疾病转归的重要预后因素。伊马替尼治疗12m后获得主要分子学缓解（MMR）的患者，即Bcr-AblmRNA表达水平较治疗前下降≥3log以上者，无疾病进展生存（PFS）率及长期生存率明显高于未达此标准者。治疗18m未获得MMR的患者可认为疗效不佳，需考虑调整治疗。近年来，实时定量逆转录PCR（RQ-PCR）技术以其敏感、定量、快速的特点被广泛用于Bcr-Abl融合基因表达水平的分析。在伊马替尼治疗过程中，通过RQ-PCR监测患者Bcr-AblmRNA表达水平已成为评价分子学反应、检测微小残留病必不可少的指标。另外，Bcr-Abl转录水平的增高也可预测继发耐药，并作为耐药患者进行点突变检测的指征。在NCCN（National Comprehensive Cancer Network）和欧洲白血病网建立的CML治疗及疗效评价指南中，提出对伊马替尼的疗效进行多方面的分子监测，建议CML患者在伊马替尼治疗过程中，定期行骨髓细胞遗传学、染色体荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）检测、Bcr-Abl转录水平的RQ-PCR检查，了解患者是否发生获得性克隆演进、基因扩增或转录增强。值得关注的是，2007年NCCN推荐将Abl激酶区点突变的分析作为治疗失败或效果不佳、出现血液学或细胞遗传学复发、Bcr-Abl转录水平增高及疾病进展的患者的分子监测指标之一。CT10激酶调节子样（CT10 regulator of kinasse-Like，CRKL）蛋白是P210Bcr-Abl蛋白的主要底物之一。CRKL基因位于22号染色体q11，属CRK基因家族。编码产物CRKL蛋白为一种重要的接头蛋白，通过其SH2、SH3结构域与多种信号传导分子如SOS、C3G、CBL、c-Abl、Bcr-Abl、P13K、CAS及Paxillin蛋白等结合，参与RAS／MAPK、JAK/STAT、P13K等信号转导途径及β1整合素介导的信号转导途径。在正常造血组织中，CRKL蛋白以非磷酸化的形式存在。而在Bcr-Abl转化细胞内，CRKL蛋白作为Bcr-Abl融合蛋白的主要底物，发生持续酪氨酸磷酸化，并与Bcr-Abl及多种信号分子相互结合形成复合物，引发一系列调控细胞生长、发育的信号转导途径的异常，在细胞的恶性转化中具有重要作用。在CML肿瘤细胞内，磷酸化CRKL（p-CRKL）蛋白与P210Bcr-Abl蛋白形成的复合物具有高度的特异性和稳定性。更重要的是，CRKL蛋白的磷酸化水平与P210Bcr-Abl的PTK活性密切相关。因此，p-CRKL可以作为研究P210Bcr-Abl蛋白的替代指标。国外已有学者通过检测CML肿瘤细胞内CRKL蛋白的磷酸化水平，研究P210Bcr-Abl蛋白的PTK活性，并将这一方法用于评价伊马替尼疗效和监测耐药。实验认为P210Bcr-Abl蛋白激酶活性被伊马替尼抑制的程度可以反应患者对伊马替尼治疗的敏感性，预测患者的缓解程度。Saunders．V等在研究中发现，p-CRKL含量在伊马替尼治疗后降低50％的患者中获得MMR的比例显著高于对照组（100％vs 56％，P<0．01）。因此，磷酸化CRKL蛋白可以反映细胞内P210Bcr-Abl被伊马替尼抑制的程度，从而可成为监测疗效、评估预后及探讨耐药机制的指标。本实验试图运用巢式RT-PCR技术、RQ-PCR技术及流式细胞仪，分别检测伊马替尼耐药和非耐药患者骨髓细胞Abl激酶区点突变、Bcr-Abl融合基因表达水平及CRKL蛋白磷酸化水平，以探讨点突变、Bcr-AblmRNA表达水平和CRKL磷酸化水平的检测，作为监测伊马替尼耐药或疗效评价指标的可能性，从而指导临床治疗。研究方法：1．选取15例伊马替尼耐药及7例初诊进展期CML患者不同时期的39份骨髓标本为研究对象，通过巢式RT-PCR扩增Abl酪氨酸激酶区序列并对扩增产物进行双向直接测序。对6例点突变、7例无突变的耐药患者及6例治疗后AP／BC患者分别在3个月和／或6个月再次进行Abl激酶区点突变分析及Bcr-Abl融合基因的双色双融合FISH检查。分析点突变对伊马替尼疗效的影响。2．采用SYBR Green I RQ-PCR技术检测伊马替尼治疗前、伊马替尼耐药和伊马替尼治疗后经FISH检查未发现Bcr-Abl融合细胞的CML患者。利用公式Folds=2（-△△Ct）进行相对定量，分别计算出耐药组、FISH阴性组患者与治疗前患者Bcr-Abl表达的倍比关系，并通过独立样本t检验比较两组患者Bcr-AblmRNA表达是否具有统计学差异。应用双变量相关分析检验耐药组患者RQ-PCR结果和FISH所测Bcr-Abl阳性细胞比例的相关性。检验水准a=0．05。3．运用流式细胞仪检测5例初诊、5例伊马替尼治疗有效及8例伊马替尼耐药患者骨髓细胞胞浆内CRKL蛋白磷酸化水平（p-CRKL％和p-CRKL的平均荧光强度MFI），应用单向方差分析判断三组标本p-CrKL％、MFI有无统计学差异。采用双变量相关分析检验p-CRKL％、MFI与第二部分实验中mRNA表达水平的相关性。检验水准a=0．05。实验结果：1．Abl激酶区点突变与伊马替尼耐药15例耐药患者中有6人（40．0％）检测到Abl激酶区点突变，涉及四种类型氨基酸的改变：Y253H（n=1）、E255K（n=1）、T315I（n=3）、F317L（n=1）。其中2人为BC（T315I、Y253H、），3人为AP（E255K、T315I、F317L），1人为CP（T315I）。7例未经伊马替尼治疗的AP／BC患者未检测到点突变。随访3个月或6个月。1例未发现点突变的耐药患者（NO．5）随访3m后，检测到F311I突变，同时Bcr-Abl阳性细胞比例从43％上升至98％。6例点突变患者仍可检测到相同类型的突变。6例AP／BC患者经伊马替尼联合化疗后，未获得主要细胞遗传学缓解，但未检测到突变。除F317L点突变患者在6m后获得CCyR外，其余5例Bcr-Abl阳性细胞比例均大于90％。2．Bcr-AblmRNA表达水平与伊马替尼耐药耐药组患者Bcr-Abl融合基因表达水平显著高于伊马替尼治疗后FISH阴性组(2（-△△CT）分别为1．50±0．49 vs 0．12±0．20，P<0．05)。耐药组患者的Bcr-AblmRNA表达比值与FISH所测Bcr-Abl阳性细胞比例存在正相关关系（rS=0．933，P<0．05）。3．CRKL蛋白磷酸化水平与伊马替尼耐药未接受伊马替尼治疗、伊马替尼治疗有效及伊马替尼耐药患者骨髓细胞内p-CRKL％、MFI存在统计学差异（F=45．371，P<0．05；F=36．361，P<0．05）。初治CML患者、伊马替尼耐药患者p-CRKL％较治疗有效患者显著增高。耐药患者与初治患者p-CRKL％无显著性差异，均呈高度磷酸化。p-CRKL％、MFI与Bcr-AblmRNA表达比值存在正相关关系（r=0．829，P<0．05；r=0．880，P<0．05）。4例Abl激酶区点突变患者较4例无点突变患者p-CRKL％、MFI高。初步结论：1．本研究采用巢式RT-PCR扩增伊马替尼耐药CML患者Abl激酶区序列，并对扩增产物双向直接测序。结果证实Abl激酶区基因的点突变是造成伊马替尼耐药的重要原因。点突变的分析有助于疗效预测、治疗干预。2．采用SYBR Green I RQ-PCR技术、Folds=2（△△Ct）相对定量计算公式，检测伊马替尼治疗前、伊马替尼耐药和治疗后FISH检查未发现Bcr-Abl融合细胞的CML患者。结果表明Bcr-Abl融合基因表达水平可以反应伊马替尼疗效，进而预测疾病的进展。Bcr-AblmRNA转录增强是伊马替尼耐药的原因之一。3．本研究应用流式细胞仪，检测P210Bcr-Abl蛋白的主要底物CRKL蛋白的磷酸化水平，建立了快速便捷的检测CML患者细胞内P210Bcr-Abl蛋白PTK活性的方法。在国内尚未见类似文献报道。4．本研究检测了初诊、伊马替尼治疗有效、伊马替尼耐药三组CML患者骨髓细胞内CRKL磷酸化水平，并与RQ-PCR检测结果进行相关性分析，结果提示p-CRKL可以用于评价患者对伊马替尼治疗的敏感性和预测疗效。对于未检测到Abl激酶区点突变的耐药患者，P210Bcr-Abl蛋白活性再激活仍是导致耐药的机制之一。
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