雌激素、胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的影响

论文摘要

随着组织工程学的不断发展,对生长板软骨细胞在体内和体外的研究也越来越深入。国内外大量的研究人员利用定量活体标记技术对哺乳类动物（包括人类）、啮齿类动物、禽类及野生动物如蝙蝠等不同种属动物的生长板生长、发育,病变发生、损伤修复机制和软骨内成骨过程等领域进行了广泛而深入的研究。鉴于鸡胚四肢骨骼是研究骨骼发育较为理想的模型之一,同时为了更深入研究生长板软骨发育不良相关疾病,如肉鸡胫骨软骨发育不良（tibial dyschondroplasia, TD）,有必要对肉鸡胫骨生长板软骨细胞进行体外培养。通过对获得的生长板软骨细胞在体外的生长及发育特征以及对生长板软骨的全身和局部调节因子如雌激素和胰岛素样生长因子-Ⅰ对其增殖和分化的影响的研究,为肉鸡胫骨软骨生长板软骨发育不良等疾病的深入研究,以及人类和其它动物的软骨体外修复,提供借鉴。试验一、鸡胚胫骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定目的：建立鸡胚胫骨生长板软骨细胞的高效分离法,并对其进行鉴定。方法：设计以1 mg·mL-1的Ⅱ型胶原酶两步消化法,分离制备胫骨生长板软骨细胞,观察其对12～20胚龄鸡胫骨生长板软骨细胞的分离效果；采用不同的染色方法,在倒置显微镜和光镜下观察体外培养条件下软骨细胞的生物学特性。结果：（1）Ⅱ型胶原酶两步消化可使生长板软骨基质完全解离降解,细胞均分离,细胞存活率达90%以上；（2）前两代细胞贴壁生长呈圆形或多角形,单个铺开时体积较大,生长汇合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝（TB）异染反应均呈阳性；第4代以后细胞逐渐变为长梭形,Ⅱ型胶原免疫组化染色减弱,TB异染反应阴性；（3）前三代软骨细胞长期培养下去,能逐渐汇合,并形成软骨块状组织,碱性磷酸酶染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性,甲苯胺蓝染色异染反应较强,茜素红染色能观察到钙化结节。结论：采用两步Ⅱ型胶原酶消化分离鸡胚胫骨生长板软骨细胞,具有细胞收获率、细胞存活率高、操作简便等特点；随着传代培养次数的增加,生长板软骨细胞出现去分化,逐渐失去软骨细胞的特异性表型；软骨细胞若有合适附着基质,长期培养下去能保持较强的成骨能力。试验二、雌激素对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响目的：在建立鸡胚胫骨生长板软骨细胞体外培养方法的基础上,研究雌激素对鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖、分化和代谢功能的影响。方法：取生长状态良好的第二代软骨细胞接种于96孔板,添加不同浓度的雌激素,分别用MTT法、PNPP法测定软骨细胞增殖率和软骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性,用全自动生化分析仪检测细胞培养液中的钙、磷、ALP含量。结果：（1）36 h,54 h,25～1600 pg·mL-1的雌激素均显著促进了软骨细胞的增殖（P<0.01）。其中,作用54 h,200,400,800pg·mL-1的雌激素促增殖作用显著；（2）54 h,400、800 pg·mL-1的雌激素显著促进生长板软骨细胞内ALP活性（P<0.01）,1600 pg·mL-1的雌激素则显著抑制软骨细胞内ALP活性（P<0.01）；（3）细胞培养液中钙浓度：在36 h,400、800 pg·mL-1雌激素作用下,明显降低,18 h,400 pg·mL-1,明显升高,54 h,随雌激素的浓度增加而增加；磷浓度：400、800 pg·mL-1雌激素作用下,在各个时间段都处于较高的水平；ALP活性：在18 h,对照组和800 pg·mL-1含量较高,36 h,100、200、800 pg·mL-1明显降低,54 h,随浓度的增加,各组ALP呈下降趋势。结论：雌激素能显著促进软骨细胞的增殖；使软骨细胞内的ALP显著增加；但浓度越大,则呈现明显的抑制作用；细胞培养液中钙、磷随培养时间延长而增高,ALP则随时间增加而降低。试验三、胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响目的：在建立鸡胚胫骨生长板软骨细胞体外培养方法的基础上,研究重组IGF-Ⅰ对鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖、分化和代谢功能的影响。方法：取生长状态良好的第二代软骨细胞于96孔板上进行重组IGF-Ⅰ作用下,用MTT法测定软骨细胞增殖率,PNPP法测定软骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性,并用全自动生化分析仪测定体外培养软骨细胞培养液中的钙、磷及ALP含量。结果：（1）在36 h,10、15、20 ng·mL-1的IGF-Ⅰ使软骨细胞增殖受到抑制（P<0.01）,随作用时间的增加各种浓度作用下的软骨细胞,均有增殖,但差异不显著；（2）在36 h,10、20、40 ng·mL-1的IGF-Ⅰ可显著促进软骨细胞内ALP活性（P<0.01）。54 h,20、40 ng·mL-1的IGF-Ⅰ可显著促进生长板软骨细胞内ALP活性（P<0.01）；（3）软骨细胞培养液中的钙、磷随IGF-Ⅰ浓度的增加而减少,随培养时间延长,其浓度有所增加。在18 h,10 ng·mL-1的IGF-Ⅰ抑制了生长板软骨培养液中ALP的活性,20、40 ng·mL-1的IGF-Ⅰ促进了软骨细胞培养液中ALP的活性。随培养时间的延长,ALP活性下降。结论：IGF-Ⅰ不能显著促进软骨细胞的增殖；但能显著增加软骨细胞内ALP的活性；随培养时间延长,细胞培养液中的钙、磷有所增加,而ALP则下降。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语说明
• 上篇 文献综述
• 第一章 软骨内成骨研究进展
• 1 软骨内成骨的过程
• 2 生长板软骨细胞的分区及其功能
• 2.1 静止细胞带（The resting zone）
• 2.2 增殖细胞带（The proliferating zone）
• 2.3 软骨细胞肥大带（The hypertrophic zone）
• 2.4 钙化带（The calcified zone）
• 2.5 骨化带（The ossification zone）
• 3 软骨细胞凋亡（The apoptosis of the chondrocyte）
• 第二章 雌激素和IGF-Ⅰ对胫骨生长板软骨作用的研究进展
• 1 雌激素对胫骨生长板软骨的作用
• 1.1 体内研究
• 1.2 基因敲除动物模型
• 2 IGF-Ⅰ对胫骨生长板软骨的作用
• 2.1 GH和IGF-Ⅰ对骨纵向生长的假说
• 2.2 全身性和局部IGF-Ⅰ对骨纵向生长的作用
• 2.3 IGF系统在胫骨生长板软骨中的分布
• 参考文献
• 第三章 肉鸡胫骨软骨发育不良研究进展
• 1 临床症状
• 2 病因
• 2.1 生长因子
• 3及其代谢物'>2.2 维生素D₃及其代谢物
• 2.3 遗传因素
• 2.4 营养因素
• 2.5 饲养管理
• 3 病理发生
• 4 防治
• 4.1 遗传选育
• 3及其衍生物'>4.2 维生素D₃及其衍生物
• 4.3 减缓生长速度
• 5 展望
• 参考文献
• 下篇 试验研究
• 第四章 鸡胚胫骨生长板软骨细胞的体外培养与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 主要试验试剂
• 1.1.3 主要仪器及设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 鸡胚胫骨生长板石蜡切片染色观察
• 1.2.1.1 胫骨组织石蜡切片
• 1.2.1.2 H·E染色
• 1.2.1.3 甲苯胺蓝染色
• 1.2.2 鸡胚胫骨生长板软骨细胞的培养
• 1.2.3 细胞的形态学观察
• 1.2.4 体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的Ⅱ型胶原免疫组化检测
• 1.2.5 体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞的染色观察
• 1.2.5.1 Gimsa染色
• 1.2.5.2 H·E染色
• 1.2.5.3 甲苯胺蓝染色
• 1.2.5.4 碱性磷酸酶染色
• 1.2.5.5 茜素红染色
• 2 结果
• 2.1 胫骨组织石蜡切片
• 2.2 倒置显微镜下观察体外培养生长板软骨细胞
• 2.3 Ⅱ型胶原免疫组化染色
• 2.4 甲苯胺蓝染色
• 2.5 常规染色结果
• 3 讨论
• 3.1 关于生长板软骨细胞的研究
• 3.2 生长板软骨细胞的体外培养
• 3.3 关于生长板软骨细胞的长时间培养
• 3.4 鸡胚胫骨生长板软骨细胞的染色鉴定
• 4 小结
• 参考文献
• 第五章 雌激素对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 数据分析
• 2 结果
• 2.1 雌激素对体外培养生长板软骨细胞作用的OD值
• 2.2 雌激素对生长板软骨细胞内ALP的OD值
• 2.3 雌激素对生长板软骨细胞培养液中钙、磷、ALP的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第六章 IGF-Ⅰ对体外培养鸡胚胫骨生长板软骨细胞增殖分化的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 IGF-Ⅰ对体外培养生长板软骨细胞作用的OD值
• 2.2 IGF-Ⅰ对生长板软骨细胞内ALP影响的OD值
• 2.3 IGF-Ⅰ对生长板软骨细胞培养液中钙、磷、ALP的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 创新之处
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录