二化螟对Cry1Ab抗性风险评估和Cry1A毒素与二化螟中肠BBMV配基结合分析

论文摘要

二化螟Chilo suppressalis（Walker）是严重威胁我国水稻生产的重要害虫之一。近年来,受耕作制度和种植结构的变化、高产优质水稻品种的大面积种植、气候等原因的影响,二化螟的发生逐年加重,并且由于化学农药的长期大量使用,二化螟的抗药性呈明显上升趋势,给防治工作来了困难。转Bt CryAb基因水稻的出现为防治二化螟提供了一种新的有效方法,但是从生物学和进化角度来看,二化螟对转Bt基因水稻也可以产生抗性是一种胁迫进化现象。因此,研究Bt毒素对二化螟的杀虫机理及二化螟对Bt产生抗性的可能机制,将为制定转基因水稻的抗性治理策略、延长转基因水稻的使用寿命等提供重要的理论依据。本文建立了3种CrylA毒素对二化螟的敏感毒力基线,评估了二化螟及对Cry1Ab的抗性风险,利用配基印迹法研究了Cry1A毒素同二化螟中肠BBMV受体蛋白的结合谱,并通过RT-PCR获得了4个APN基因的cDNA片段。1.二化螟对Cry1Ab的抗性筛选及抗性风险评估用毒蛋白涂表法测定了2002年采自浙江苍南的二化螟室内品系对Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac活化毒蛋白的敏感性水平,建立了3种毒素对二化螟的敏感毒力基线。结果表明,Cry1Ab对该品系的毒力最高(LC50为0.14μg/cm2),其次是Cry1Ac(LC50为0.37)和Cry1Aa(LC50为0.49μg/cm2)。用Cry1Ab对2006年采自江苏句容、安徽合肥和宣城、浙江杭州的田间二化螟混合种群（JAZ）进行12代的抗性筛选,其对Cry1Ab的敏感性下降了3.3倍。平均抗性现实遗传力h2为0.068,表明抗性风险较低。根据平均抗性现实遗传力、毒力回归线平均斜率进行估算,在50%-95%的选择压力下,二化螟对Cry1Ab的抗性上升10倍需要26至8代。2.二化螟中肠受体与Cry1A毒素结合分析配基结合分析结果表明二化螟CN品系幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）中有6个Cry1Ac结合蛋白（分子量分别为180,160,120,90,70和50 kDa）,其中180、160和90 kDa结合蛋白的条带明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白结合浓度较高。同源竞争结合结果表明,180和90 kDa结合蛋白为Cry1Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cry1Ac和Cry1Ab受体结合部位的交叉反应,本文还进行了异源竞争结合研究。研究结果表明,Cry1Ab可以与Cry1Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,其中与180、120、70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性.上述结果表明,Cry1Ac与Cry1Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上具有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合力有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cry1Ac和Cry1Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。进一步分离、鉴定二化螟幼虫中肠BBMV中Cry1A毒素的受体蛋白将有助于研究Cry1A毒素的作用机理和二化螟对Cry1A毒素的抗性机理。3.二化螟中肠APN类受体基因片段cDNA的克隆氨肽酶N（aminopeptidase N,APN）受体是昆虫体内Bt毒素的重要作用靶标。本研究利用简并引物,从二化螟中肠中获得4个不同的APN类受体基因cDNA片段。该片段长约600bp,编码约200个氨基酸残基,分别命名为CsAPN1、CsAPN2、CsAPN3和CsAPN4。CsAPN1同家蚕APN（GenBank No.:BAA32140）氨基酸序列相似性高达73%,CsAPN2同二化螟APN（GenBank No.:ABC69855）的相似性高达100%,CsAPN3同棉铃虫APN2（GenBank No.:AAP37951）相似性为68%,CsAPN4同欧洲玉米螟APN3（GenBank No.:ABL01483）相似性为77%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 二化螟
• 1 分布与危害
• 2 发生情况
• 3 发生原因分析
• 3.1 气候变化
• 3.2 耕作栽培制度与水稻品种的变化
• 3.3 天敌控制作用的减弱
• 3.4 抗药性的发展
• 4 抗药性现状
• 4.1 敏感期
• 4.2 抗性发展期
• 4.3 多种抗性发展期
• 5 抗药性产生的机制
• 5.1 表皮穿透
• 5.2 解毒酶的代谢及结合作用增强
• 5.2.1 多功能氧化酶系
• 5.2.2 酯酶
• 5.2.3 谷胱甘肽-S-转移酶
• 5.2.4 DDT-脱氯化氢酶
• 5.3 靶标敏感性下降
• 5.3.1 γ-氨基丁酸门控氯离子通道
• 5.3.2 钠离子通道
• 5.3.3 烟碱型乙酰胆碱
• 5.3.4 乙酰胆碱酯酶
• 5.4 蛋白质的结合作用
• 转基因植物
• 1 转基因的方法
• 1.1 基因枪法
• 1.2 PEG诱导法
• 1.3 电击法
• 1.4 花粉管通道法
• 1.5 农杆菌介导的基因转化法
• 1.6 其他方法
• 2 Bt转Bt基因作物
• 2.1 转Bt基因烟草
• 2.2 转Bt基因棉花7
• 2.3 转Bt基因马铃薯
• 2.4 转Bt基因豆类作物
• 2.5 转Bt基因花生
• 2.6 转Bt基因玉米
• 2.7 转Bt基因高粱
• 2.8 转Bt基因水稻
• 3 转基因作物的生态风险
• 3.1 转基因作物基因漂流导致的杂草化问题
• 3.1.1 转基因作物本身"杂草化"
• 3.1.2 转基因作物通过"基因漂移"使杂草成为"超级杂草"
• 3.2 转基因作物抗虫作物的潜在风险
• 3.3 转基因作物对非靶标生物和生物多样性的影响
• 3.3.1 对非靶标生物的影响
• 3.3.2 对生态系统多样性的影响
• 3.4 转基因作物的食品安全性分析
• 4 保障转基因作物的生态安全性措施
• 4.1 加强对转基因作物的安全性评价
• 4.2 采用生殖隔离,阻断转基因花粉的漂移
• 4.3 转基因遗传调控
• 4.4 推广时种植一定比例的非转基因同类作物
• 苏云金菌芽孢杆菌
• 1 Bt的发现和历史
• 2 Bt基因的分类与命名
• 2.1 Hofte分类法
• 2.2 Crickmore分类法（Crickmore et al.,1998）
• 2.3 其它分类方法
• 3 Bt晶体蛋白的结构功能关系
• 4 Bt的杀虫机理
• 5 Bt毒素的结合受体
• 5.1 受体与Bt毒素的结合动力学
• 5.2 钙粘蛋白（Cadherin-like protein,CAD）
• 5.2.1 类钙粘蛋白的结构特征
• 5.2.2 类钙粘蛋白与毒素的结合特性
• 5.3 GPI锚定蛋白（GPI-anchored protein）
• 5.3.1 氨肽酶
• 5.3.2 碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatese,ALP）
• 5.4 其他类型受体
• 6 Bt的抗性机理
• 6.1 昆虫体内可能对Bt产生抗性的环节
• 6.2 三种主要的抗性机理
• 6.2.1 蛋白酶水解发生变化
• 6.2.2 中肠受体的变异
• 6.2.3 中肠上皮的缺失修复作用
• 7 Bt的抗性遗传方式及抗性风险评估
• 7.1 Bt的抗性遗传方式
• 7.2 Bt抗性风险评估
• 第二章 二化螟对Cry1Ab抗性筛选及抗性风险评估
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试昆虫及其饲养
• 1.1.2 供试药剂
• 1.1.3 试验器材
• 1.1.4 二化螟人工饲料
• 1.2 生物测定方法（毒素涂表法）
• 1.3 二化螟对Cry1A毒素敏感毒力基线的建立
• 1.4 抗性品系的筛选
• 1.5 抗性现实遗传力
• 1.6 抗性预测
• 1.7 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 敏感毒力基线的建立
• 2.2 抗性筛选
• 2.3 二化螟对Cry1Ab抗性现实遗传力
• 3 讨论
• 第三章 二化螟中肠受体与Cry1A毒素结合分析
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试昆虫
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 二化螟中肠BBMV的制备
• 1.2.2 SDS-PAGE电泳检测
• 1.2.3 Cry1A毒素生物素（biotin）标记
• 1.2.4 Cry1A毒素与受体的配基结合
• 1.2.5 Cry1A毒素竞争结合
• 1.2.6 蛋白质含量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 SDS-PAGE电泳结果
• 2.2 Cry1A毒素与二化螟中肠BBMV配基结合
• 2.3 二化螟中肠BBMV与Cry1Ab毒素的同源竞争结合
• 2.4 二化螟中肠BBMV与Cry1Ac毒素的竞争结合
• 3 讨论
• 第四章 二化螟中肠APN类受体基因片段克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 细菌培养基
• 1.3 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
• 1.4 主要试剂
• 1.5 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 RNA的提取（SV Total Isotation system）
• 2.2 Invitrogen:M-MLV反转录
• 2.3 cDNA模板质量检测
• 2.4 兼并引物扩增
• 2.5 PCR产物的回收与纯化
• 2.6 PCR纯化产物与质粒载体的连接
• 2.7 转化
• 2.8 细菌的扩大培养
• 2.9 质粒DNA的提取
• 2.10 酶切反应
• 2.11 目标片段检测
• 2.12 序列分析与系统发育树的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 检测cDNA模板
• 3.2 兼并引物扩增结果
• 3.3 二化螟氨肽酶受体基因的cDNA片段的克隆与序列分析
• 3.4 二化螟APN基因的系统进化分析
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录:发表的学术论文
• 致谢