论文摘要
研究背景:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是缺血性心脑血管疾病的病理基础,其发病机制至今尚未阐明。近年来认为免疫炎症特别是由巨噬细胞介导的天然免疫在AS的发生发展中起重要作用。Siglec-1（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,唾液酸黏附素,又名CD169）作为单核巨噬细胞激活的重要标志,在SLE、系统性硬化、HIV感染等自身免疫性疾病和炎症性疾病外周血及病变组织表达增高,并参与分泌细胞因子和激活T淋巴细胞等过程。但其在冠心病发病过程中的作用还不清楚。目的:本研究拟通过外周血分析、体外细胞培养和体内动物实验三个层次,研究siglec-1在冠心病患者中的表达及其在AS发病过程中的作用,探讨siglec-1作为评价疾病活动性的指标或作为潜在治疗靶点的价值。方法:（1）外周血表型分析a)流式细胞仪检测冠心病病人和正常对照组外周血单核细胞CD14CD169双阳性细胞比例。b)分离外周血单个核细胞,抽提总RNA,反转成cDNA,实时荧光相对定量PCR检测siglec-1 mRNA表达情况。c)根据冠状动脉造影结果,计算冠心病病人冠状动脉狭窄程度评分Gensini Score,并与siglec-1表达作相关性分析。d)检测冠心病危险因子超敏C反应蛋白（hs-CRP）和同型半胱氨酸（HCY）,并与siglec-1表达作相关性分析。（2）体外细胞培养a)体外培养RAW264.7巨噬细胞株及原代小鼠骨髓巨噬细胞。b)各种刺激剂如ox-LDL、M-CSF、INF-α等刺激巨噬细胞siglec-1高表达;小干扰RNA或抗体阻断技术抑制siglec-1表达。c)观察各组巨噬细胞分泌趋化因子MCP-1、MIP-1alpha、MIP-2和吞噬ox-LDL的能力。d)磁珠分选外周血CD4+、CD8+、CD14+细胞,单核细胞（CD14+）和淋巴细胞（CD4+、CD8+）混合培养观察单核细胞siglec-1抑制和表达增强后刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子的变化。（3）动物实验a)高脂喂养ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型。b)构建带siglec-1小干扰序列的慢病毒载体和对照病毒载体,尾静脉注射小鼠,靶向敲除siglec-1后再高脂喂养4个月,观察小鼠粥样斑块形成。c)免疫组化观察粥样斑块中CD4+T细胞、CD8+T细胞及巨噬细胞数量。d)荧光定量PCR检测主动脉IL-1β、TNF-α炎性细胞因子分泌情况。结果:（1）外周血表型分析a)流式细胞仪检测发现,Siglec-1在正常对照组及冠心病组淋巴细胞和中性粒细胞上均无表达;冠心病组单核细胞CD14CD169双阳性率为（11.5±3.9）%,显著高于健康对照组的阳性率[（1.8±2.0）%,P<0.01]。b)冠心病组Siglec-1 mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组,为健康对照组的3.17倍;而冠心病血脂正常组和血脂异常组的Siglec-1阳性率和mRNA平均拷贝数均无明显差异。c)冠心病患者siglec-1 mRNA表达和冠心病严重程度评分Gensini Score及炎症活动指标hs-CRP、HCY三者成正相关（相关系数r和p值分别为: r=0.338, P=0.015; r=0.316, P=0.016; r=0.224, P=0.042）。（2）体外细胞培养a)各种刺激剂如ox-LDL、M-CSF、INF-α等能有效刺激巨噬细胞siglec-1高表达;小干扰RNA或抗体阻断能特异性抑制siglec-1表达。b) siglec-1高表达后可以明显促进巨噬细胞MCP-1、MIP-1alpha及MIP-2的分泌和吞噬ox-LDL,而siglec-1表达降低后上述作用逆转。c)冠心病患者外周血CD14+单核细胞比正常人单核细胞具有更强的刺激T细胞增殖和促炎性细胞因子分泌的作用。当用INF-α上调正常人单核细胞siglec-1表达后,单核细胞刺激CD4+和CD8+ T细胞增殖能力增强,刺激CD4+T细胞促炎性细胞因子（IL-2、IL-12、INF-γ）分泌能力增强,抗炎性细胞因子（IL-10）分泌减弱,并且这种作用可通过siRNA或抗siglec-1单抗靶向阻断而逆转。（3）动物实验a)小干扰siglec-1组比对照病毒组动脉粥样斑块形成缓慢,斑块面积占动脉总面积分别为（14.043±1.342）%和（33.487±2.715）%,p<0.001。b)小干扰siglec-1组比对照病毒组粥样斑块中CD4+T细胞、CD8+T细胞及巨噬细胞浸润数量少;IL-1β、TNF-α炎性细胞因子分泌能力低（分别为0.2646±0.0387 vs. 1.0032±0.0969, p<0.001和0.1820±0.0193 vs. 1.0119±0.1964, p<0.01）。结论:siglec-1作为一种反映冠心病严重程度和炎症活动性的无创性指标,在ox-LDL等刺激下表达增高,参与巨噬细胞吞噬ox-LDL,演变成泡沫细胞,并激活巨噬细胞,分泌MIP-1 alpha、MCP-1和IL-8等趋化因子,募集更多巨噬细胞和淋巴细胞到粥样斑块,并参与激活CD4+/CD8+T淋巴细胞,参与粥样斑块中的炎症反应。靶向抑制siglec-1表达可阻止上述过程,减轻炎症反应。因此,通过分子生物学手段或抗体技术阻断巨噬细胞siglec-1表达有望成为一种潜在的治疗或预防动脉粥样硬化发生发展的新方法。
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相关论文文献
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