金樱子总黄酮的制备及生物活性研究

论文摘要

目的：制备金樱子总黄酮（TFs）并考察其生物活性。方法：本研究主要从以下方面进行：（1）TFs的制备及质量。以总黄酮的含量为测定对象,利用正交试验法优选总黄酮的提取工艺条件；通过D101大孔树脂工艺制备高纯度的总黄酮（TFs）；并通过HPLC指纹图谱和对水解产物黄酮苷元的测定来建立质量标准。（2）总黄酮体内外抗氧化活性实验。在体外考察其对DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、·OH（羟基自由基）、·O-2（超氧阴离子）和H2O2（过氧化氢）的清除作用以及还原力的测定,并考察了其对红细胞溶血和脂质过氧化的抑制作用,以维生素C （Vit C）作为阳性对照。此外,通过给药后小鼠血清、肝和肾组织中T-AOC（总抗氧化能力）,SOD（超氧化物岐化酶）和MDA（丙二醛）水平的变化来评估它的体内抗氧化能力。（3）总黄酮对小鼠高脂血症的保护作用及其机制研究。正常小鼠分别给予高脂饮食和不同给药剂量总黄酮（25,50 mg/kg, i.g.）,并以非诺贝特为阳性对照。实验结束后,通过测定血清的TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）和HDL-C（高密度脂蛋白）的水平评价其降脂活性。通过组织病理学、ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）和ALP（碱性磷酸酶）等指标的测定探讨总黄酮对高脂饮食所致的脂肪肝的保护作用。此外还考察了其对实验动物中体内抗氧化系统的影响。（4）总黄酮对高脂血症大鼠的治疗作用及其血液流变学影响。造模后的高脂大鼠给予总黄酮（100 mg/kg）和阳性对照药非诺贝特4周。实验结束后测定血清的TC、TG和HDL-C水平评价其降脂活性。并通过测定血液流变学的变化来验证其降脂活性。（5）总黄酮对扑热息痛诱导的急性小鼠肝损伤的保护作用及其机制研究。在这项研究中,小鼠分别被灌胃不同剂量的总黄酮（50和200 mg／kg）和联苯双酯（100 mg/kg）5天,在最后一次给药2h后,除空白组所有实验动物腹腔注射扑热息痛（400 mg/kg）.实验结束后,测定血清的ALT、AST、MDA、SOD和GSH（谷胱甘肽）等指标来考察TFs对肝损伤的保护作用和体内抗氧化系统的影响。并通过Western blotting、免疫组化和RT-PCR等技术来考察相关蛋白和mRNA的表达水平。（6）通过急性毒性试验来初步考察金樱子总黄酮的毒性。结果：正交试验法优化的金樱子最佳提取条件是用8倍量的60%乙醇回流提取2 h,共2次；D101树脂制备工艺是用4倍树脂柱床体积的水除杂和6倍树脂柱床体积的40%乙醇洗脱得到纯度为78.45%的TFs。产物经水解后经HPLC分析显示槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量为7.37%。体内外抗氧化活性实验显示TFs对DPPH,·OH和·O-2有较强的清除作用,其IC 50值分别为0.01、0.04和0.08 mg/mL,还原力稍弱于阳性对照Vit C。TFs在浓度为0.35 mg/mL和2.00 mg/mL时,还分别具有71.62%和48.45%的红细胞溶血和脂质过氧化的抑制作用。在体内抗氧化方面,TFs（100mg/kg）能明显提高血清和肝和肾组织中T-AOC和SOD的水平,并显著降低MDA；TFs在50 mg/kg的给药剂量时,高脂血症小鼠血清TC、TG和LDL-C水平分别下降了45.02%、33.86%和73.68%,而HDL-C则显著高于模型组,与阳性药相比（分别降低39.22%、36.06%和76.08%）药效相当。组织病理学、ALT、AST和ALP等指标均显示TFs对肝脏具有良好的保护作用,其中,ALT、AST和ALP分别升高了55.85%、29.15%和25.68%。此外,TFs能显著降低MDA水平,提高CAT（过氧化氢酶）、SOD、GSH、GPX（谷胱甘肽过氧化酶）水平；TFs对高脂大鼠的治疗作用及其血液流变学研究显示金樱子总黄酮在给药100 mg/kg时对高脂大鼠的血清TC和TG分别极显著地降低了60.80%和62.39%（p<0.01）,略强于非诺贝特（40 mg/kg,分别降低56.82%和56.99%）。TFs能降低全血比粘度（低切、高切）49.59%和63.24%（p<0.01）,血浆比粘度、血清比粘度和RBC聚集指数均明显降低（p<0.05）,而纤维蛋白含量无明显变化。与模型组相比,在对扑热息痛诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用中,高剂量给药组小鼠血清的ALT、AST和MDA分别下降由78.42%、70.85%和30.52%,而SOD和GSH显著高于模型组（p<0.05）,强于阳性药的效果。TFs能显著提高Procaspase-3、Procaspase-8、FasL、Prohibitin和Bcl-2的蛋白表达水平,明显降低中Fas、Bax、p53和NF-κB p65的蛋白表达,同时下调TNF-α的表达。在急性毒性实验中,我们发现金樱子总黄酮在给药剂量为20 g／kg时未见任何动物死亡。结论：本实验中从中药金樱子中制备得到的总黄酮,具有制备工艺简单、含量高、质量可控等优点,适合于工业化生产。进一步的药效活性显示制备得到的总黄酮具有显著的体内外抗氧化活性、对高脂血症及心脑血管疾病有着很好的预防和保护作用,同时也对药物性肝损伤有着很好的保护作用。以上结果表明金樱子总黄酮在预防和治疗心脑血管疾病和肝损伤保护等方面具有较大的研究和开发价值,但是有关其长期毒性、物质基础、作用机制、其它模型上的心脑血管活性及肝损伤保护作用还需深入研究。

论文目录

• 一、摘要
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、正文
• （一） 前言
• （二） 实验部分
• 第一章 金樱子总黄酮的提取、制备及其质量标准的建立
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 第二章 金樱子总黄酮的体内外抗氧化实验
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 4 小节
• 第三章 金樱子总黄酮对小鼠高脂血症的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四章 金樱子总黄酮对大鼠高脂血症及其血液流变学的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第五章 金樱子总黄酮对小鼠扑热息痛急性肝损伤的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第六章 金樱子总黄酮的急性毒性试验
• 1 实验动物
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• （三） 结论
• （四） 参考文献
• 四、附录
• 五、致谢