济南市黑虎泉趋磁细菌的纯培养及多样性分析

论文摘要

趋磁细菌广泛分布在水体或沉积物的化学梯度变化层中,是一类能够沿着磁场方向和氧浓度梯度方向运动的革兰氏阴性细菌。趋磁细菌及其体内的磁小体在生物磁学和纳米磁性材料等方面具有十分重要的研究意义和应用价值。然而,由于趋磁细菌对生存条件非常苛刻,目前只有10余株趋磁细菌在实验室得到了纯培养。本论文以山东省济南市黑虎泉中的未培养趋磁细菌为研究对象,通过透射电镜在形态上对趋磁细菌进行了研究。结果显示,黑虎泉的趋磁细菌主要以球菌为主,螺菌,弧菌,杆菌相对较少。磁小体链有单链,双链,四条链以及多条链,还发现了一些磁小体不规则排列的趋磁细菌。在同一地点不同季节采样获得的趋磁细菌的形态差异很大,说明趋磁细菌对所处的微环境极为敏感,其群落随季节的变化而变化。通过PCR-RFLP的方法得到了13条16SrRNA基因序列,并构建了系统发育树,结果显示1条序列可能为趋磁杆菌序列,其余均为球菌序列。其中有一条序列和德国的一株未培养趋磁球菌CF23序列相似性高达99%,说明趋磁细菌种群在全世界的分布不但具有多样性,还具有相似性。趋磁细菌对环境的影响十分敏感,一些外界因素的改变可能会改变其群落结构,因此,通过改变实验室富集条件来研究趋磁细菌生态位群落结构的变化,通过这种变化来进一步推测其生存条件。本论文利用了DGGE的分子生物学方法分别研究了水中所有细菌和趋磁细菌在不同实验室富集条件下的动态变化。研究表明,趋磁细菌很可能和水中其它的一些细菌存在着共生关系,因此导致其纯培养的困难,并且温度是导致趋磁细菌种群动态变化的一个重要因素。结果显示,在16℃,pH为8.0,营养浓度适中的条件下趋磁细菌的多样性最丰富。在这些实验结果都对纯培养趋磁细菌提供了宝贵的信息。本论文还对黑虎泉的趋磁细菌纯培养进行了尝试,我们尝试了各种化学合成培养基梯度培养法,琼脂和原位沉积物制成的培养基梯度培养法,原位培养法,氧梯度培养基培养法等,还是未能得到趋磁细菌的纯培养。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 趋磁细菌简介
• 1.1.1 趋磁细菌的多样性
• 1.1.2 趋磁细菌的系统发育研究
• 1.2 趋磁细菌的生态学研究
• 1.2.1 海洋生境
• 1.2.2 淡水生境
• 1.2.3 其它生境
• 1.2.4 趋磁细菌多样性研究方法及进展
• 1.3 趋磁细菌磁小体的合成机制
• 1.3.1 磁小体膜囊泡的形成
• 1.3.2 磁小体蛋白质定位到磁小体膜上及磁小体膜的链状排列
• 1.3.3 细胞中铁的摄取
• 1.3.4 磁小体的生长和成熟
• 1.4 趋磁细菌的纯培养
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 黑虎泉趋磁细菌的形态分析
• 2.1 材料方法
• 2.1.1 样品的采集和保存
• 2.1.2 倒置显微镜观测
• 2.1.3 趋磁细菌的收集
• 2.1.4 趋磁细菌的透射电镜样品的制备及观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 黑虎泉趋磁细菌的形态多样性
• 2.2.2 黑虎泉趋磁细菌磁小体排列方式及形态的多样性
• 2.2.3 不同季节采样趋磁细菌种类的变化
• 2.3 本章小结
• 第三章 黑虎泉趋磁细菌系统发育树的分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 实验器材
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 缓冲液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 样品的采集和保存（同第二章）
• 3.2.2 倒置显微镜的观测（同第二章）
• 3.2.3 趋磁细菌的收集（同第二章）
• 3.2.4 试剂盒提取趋磁细菌基因组
• 3.2.5 引物设计
• 3.2.6 PCR反应体系及程序
• 3.2.7 PCR产物的纯化及连接
• 3.2.8 E.coli DH5α感受态制备
• 3.2.9 E.coli DH5α转化
• 3.2.10 试剂盒提取质粒
• 3.2.11 RFLP方法筛选16S rRNA基因克隆文库
• 3.2.12 DNA序列测定
• 3.2.13 序列比对分析及系统发育树构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 样品DNA及细菌特异性PCR的扩增
• 3.3.2 限制性片段长度多态性（RFLP）图谱分析
• 3.3.3 黑虎泉趋磁细菌的16S rDNA系统发育分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 不同实验室富集条件下趋磁细菌生态位群落结构分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 样品的采集和保存
• 4.2.2 趋磁细菌的收集（同第二章）
• 4.2.3 趋磁细菌的透射电镜样品的制备及观察（同第二章）
• 4.2.4 试剂盒提取趋磁细菌基因组（同第三章）
• 4.2.5 水样中总DNA的提取
• 4.2.6 引物设计
• 4.2.7 PCR反应体系及程序
• 4.2.8 DGGE试剂准备
• 4.2.9 DGGE垂直电泳
• 4.2.10 DGGE水平电泳
• 4.2.11 染色及照相
• 4.2.12 DGGE有关条带的回收及其序列分析
• 4.3 结果及分析
• 4.3.1 PCR优化的策略
• 4.3.2 DGGE垂直电泳
• 4.3.3 DGGE水平电泳
• 4.3.4 DGGE有关条带的序列分析
• 4.3.5 不同温度保温下趋磁细菌的种群变化
• 4.3.6 不同pH富集下趋磁细菌的种群变化
• 4.3.7 改变泉水营养浓度后趋磁细菌的种群变化
• 4.4 本章小结
• 第五章 黑虎泉趋磁细菌的培养尝试
• 5.1 材料方法
• 5.1.1 样品的采集和保存（同第二章）
• 5.1.2 倒置显微镜观测（同第二章）
• 5.1.3 趋磁细菌的收集（同第二章）
• 5.1.4 培养基
• 5.1.5 培养方案
• 5.2 结果与分析
• 5.3 本章小结
• 全文总结
• 主要结论
• 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表