苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因的鉴定

论文摘要

淀粉质原料是迄今最为广泛应用的工业原料,淀粉酶是降解此类原料的一类酶,其中包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、解支酶等,特别是由于大量的支链淀粉的存在使得解支酶显得更为的重要。但是由于种种的原因对解支酶的开发利用规模还较小,所以近年来渐渐引起人们的关注。普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）,能够专一性的催化支链淀粉型多糖α-1,6-糖苷键的水解,从而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链长不一的直链淀粉。普鲁兰酶就是一种典型的解支酶。普鲁兰酶的水解性质就决定了它具有提高淀粉质原料利用率、降低粮耗的作用,在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。本研究的目的是探索利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统来表达来自于苏云金芽孢杆菌的普鲁兰酶基因。经过序列分析可知苏云金芽孢杆菌有两段基因可能编码普鲁兰酶,分别标注为amyX和pulA。本文通过PCR的方法从苏云金芽孢杆菌的染色体上扩增得到此普鲁兰酶基因,通过测序鉴定与报道的苏云金芽孢杆菌konkukian亚种的普鲁兰酶基因的序列完全一致。分别构建表达载体pET-28a-amyX和pHSG-pulA分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中获得了表达。通过酶活的测定在两种重组菌中都检测到了酶活。同时对重组芽孢杆菌所产的重组酶的酶学性质作了初步的研究。重组酶的最适作用pH值约6.5,pH 6-8范围酶较稳定。最适作用温度大约在50℃,40℃-70℃为酶的稳定温度范围,同时将酶70℃保温45 min,仍然保持约50%的酶活力。对重组质粒的稳定考察发现pET-28a-amyX在大肠杆菌中稳定性较好,而对于芽孢杆菌表达载体pHSG-pulA在传代过程中发生了质粒丢失的现象,无选择压力下连续转接5次,几乎全部发生丢失。对重组菌的发酵条件进行了初步的优化,分别考察了碳源、氮源、培养基初始pH、装液量、接种量以及诱导时机对产酶的影响。得到了最终的优化培养基,其成分为:可溶性淀粉2%,酵母膏1%,蛋白胨1%, NaCl 1%, K2HPO4 0.017%, MgSO4·7H2O 0.012% , MnSO4·7H2O 0.012%,调节初始pH值为8.0,装液量为250 mL摇瓶加入培养基20 mL,接种量10%,培养4 h后加入IPTG诱导培养8 h,测定酶活。在此条件下重组菌的产酶水平达到3.4 U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 普鲁兰酶的应用
• 1.2.1 普鲁兰酶在高葡萄糖浆生产中的应用
• 1.2.2 普鲁兰酶在生产高麦芽糖浆中的应用
• 1.2.3 普鲁兰酶在干啤酒生产中应用
• 1.3 普鲁兰酶的研究进展
• 1.3.1 普鲁兰酶的生产菌种
• 1.3.2 普鲁兰酶基因工程研究进展
• 1.4 枯草芽孢杆菌体系研究进展
• 1.5 本研究的立题意义和研究内容
• 1.5.1 立题意义
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因amyX的鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 工具酶和试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 分子克隆技术
• 2.1.6 酶活力测定
• 2.1.7 重组质粒的稳定性分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）普鲁兰酶基因的克隆
• 2.2.2 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.3 酶活力的测定
• 2.2.4 重组质粒稳定性分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中分泌表达及重组酶酶学性质初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 工具酶和试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 分子克隆技术
• 3.1.6 酶活测定
• 3.1.7 重组酶酶学性质初步研究
• 3.1.8 重组质粒稳定性分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 表达载体pHSG 的构建
• 3.2.2 产普鲁兰酶重组枯草芽胞杆菌的构建
• 3.2.3 重组菌酶活的测定
• 3.2.4 重组酶的酶学性质的测定
• 3.2.5 重组质粒稳定性分析
• 3.3 本章小结
• 第四章 重组芽孢杆菌的培养基及发酵条件初步优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 酶活测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 碳源对产酶的影响
• 4.2.2 氮源对产酶的影响
• 4.2.3 培养基初始pH 对产酶的影响
• 4.2.4 装液量对产酶的影响
• 4.2.5 接种量对产酶的影响
• 4.2.6 诱导时机对产酶的影响
• 4.2.7 优化培养条件下重组菌产酶情况的考察
• 4.3 本章小结
• 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文