衣藻纤毛长度调控机制的研究

论文摘要

纤毛/鞭毛是以细胞微管为核心，突起于细胞表面的保守细胞器。纤毛在很多物种细胞都有分布，在脊椎动物细胞分布更为广泛几乎所有细胞表面都有纤毛。纤毛长度受到精准的调控，同种类型细胞的纤毛长度基本一致。这种常见的细胞器在细胞信号传导、细胞分裂、细胞运动以及动物发育过程中发挥着重要作用，其结构缺陷和长度异常还会造成很多人类疾病。纤毛呈现出近似圆柱体的形状，体积大小可以直接通过长度来定量。同时作为一种便于观察的细胞器，纤毛的长度很容易测量，纤毛是研究细胞器大小调控的理想模型。纤毛长度控制机制的研究有多方面的意义，不但能为人类纤毛相关疾病提供理论依据，还能帮助我们了解细胞器大小调控的基本过程。纤毛长度调控理论目前还存在很大的争论，主要争议点在于细胞能否感受自身纤毛长度，并作出相应的调节，而这个问题的关键在于是否存在活性分子，其活性随纤毛长度变化出现相应的活性变化，而活性变化又反过来调节纤毛长度。我们主要使用衣藻研究纤毛，原来的研究发现，伴随着纤毛解聚和切割，衣藻蛋白激酶CALK发生SDS-PAGE敏感的磷酸化修饰，而在纤毛再生过程中，CALK的磷酸化状态与纤毛长度紧密相关。本研究鉴定了CALK的激酶活性调控位点为第193位苏氨酸（T193），位于激酶保守结构域第八亚区活化环上，和CALK同源蛋白Aurora T288类似，CALKT193磷酸化与否直接决定CALK磷酸化底物的能力。实验显示在无纤毛细胞中CALK的激酶活性很低，随着纤毛再生变长，CALK激酶活性逐渐增加，在纤毛达到全长时，恢复到正常水平；而在纤毛解聚过程中，CALK激酶活性出现迅速上调，而随着纤毛逐渐变短，CALK激酶活性逐渐下降，结合纤毛长度突变体，证实CALK活性调节和纤毛长度变化呈现线性关系。本研究还发现，T193磷酸化修饰并非原来报道的SDS-PAGE敏感的磷酸化，后者发生在蛋白C端非激酶区，可能对CALK的激酶活性起到调节作用。这些实验证实，在纤毛解聚和组装过程中，蛋白激酶CALK调控位点T193的磷酸化状态可以直接地连续地反映纤毛长度信号，为细胞主动感受自身纤毛长度的负反馈机制提供了强有力的证据。我们还利用比较蛋白组学手段，利用定量技术分析再生短纤毛和全长纤毛中，纤毛蛋白的的含量，确定了纤毛蛋白的组装顺序，为纤毛结构的极性现象和纤毛长度研究提供了新的线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号对照表
• 第1章 引言
• 1.1 纤毛
• 1.1.1 纤毛的形成
• 1.1.2 纤毛的结构
• 1.1.3 纤/鞭毛内运输机制（Intraflagellar Transport，IFT）
• 1.1.4 纤毛的功能
• 1.1.5 纤毛与人类疾病
• 1.2 纤毛的极性和长度调控
• 1.2.1 纤毛的极性
• 1.2.2 纤毛的长度调控
• 1.3 本论文选题意义及研究内容概述
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验用菌株和载体
• 2.1.2 实验用衣藻株系
• 2.1.3 抗体、生化试剂及试剂盒
• 2.1.4 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因克隆与质粒构建
• 2.2.2 蛋白质的原核表达
• 2.2.3 酵母菌实验方法
• 2.2.4 衣藻实验方法
• 第3章 纤毛长度调控 CALK 激酶活性
• 3.1 引言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 本章实验方法
• 3.3 实验结果和分析
• 3.3.1 CALK 及其同源蛋白生物信息学分析
• 3.3.2 CALK 激酶活性调控位点的确认
• 3.3.3 针对 CALK 激酶区 T193 磷酸化修饰特异性抗体制备
• 3.3.4 CALK SDS-PAGE 敏感的磷酸化并非 T193 位的磷酸化
• 3.3.5 去除纤毛过程中 CALK 激酶活性的变化
• 3.3.6 纤毛再生过程中 CALK 的激酶活性变化
• 3.3.7 CALK 的激酶活性和纤毛长度呈现线性正相关
• 3.3.8 CALK 的激酶活性在突变体中也与纤毛长度呈正相关
• 3.3.9 CALK 以及活性 CALK 在细胞中的定位
• 3.3.10 CALK 可能调控纤毛前体蛋白进入纤毛的速率
• 3.3.11 CALK 活性调节纤毛长度初步研究
• 3.4 本章总结
• 第4章 CALK 激酶活性的调控
• 4.1 引言
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 本章实验方法
• 4.3 实验结果和分析
• 4.3.1 在纤毛解聚和纤毛切割过程中 CALK 自我激活
• 4.3.2 CALK 的 C 端对于其激酶活性的调控
• 4.3.3 CALK 相互作用蛋白的初步鉴定
• 4.3.4 CALK 候选相互作用蛋白验证
• 4.4 本章小结
• 第5章 纤毛的比较蛋白组学研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 本章实验方法
• 5.3 实验结果和分析
• 5.3.1 纤毛蛋白的内源标记和样品收集
• 5.3.2 质谱结果分析
• 5.3.3 质谱结果验证
• 5.4 本章讨论
• 第6章 工作总结和讨论
• 6.1 工作总结
• 6.2 讨论
• 6.2.1 CALK 如何感知纤毛长度信号
• 6.2.2 CALK 如何调控纤毛长度
• 6.2.3 CALK 激酶活性和 C 端磷酸化的关系
• 6.2.4 CALK 激酶活性与纤毛长度调控
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 常用溶液配制方法
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果