巴西橡胶树乳管中与14-3-3蛋白相互作用的蛋白的分离与鉴定

论文摘要

天然橡胶是在橡胶树的乳管内合成,以胶乳（乳管细胞的细胞质）的形式贮存,是一种重要的次生代谢产物。天然橡胶的基本化学单元是顺1,4-聚异戊二烯,是通过甲烃戊酸（mevalonate, MVA）途径产生前体异戊烯基二磷酸（isopentenyl diphosphate, IPP）, IPP在一系列酶的作用下合成天然橡胶。目前国内外的研究主要集中在对合成途径中关键酶的分离纯化、酶特性分析、基因的同源克隆及表达等方面,而天然橡胶生物合成调节的分子机制仍然不清楚。14-3-3蛋白在调控植物基础代谢中处于中心地位,通过与代谢相关的酶或蛋白等的相互作用来调控糖、氨基酸、核酸和蛋白质等物质的生物合成；14-3-3蛋白还通过与转录因子和其他信号分子结合参与调控植物细胞信号转导。橡胶树的乳管是一种特化的组织,乳管中的14-3-3蛋白的作用目前还不清楚,本研究通过酵母双杂交技术筛选与鉴定了橡胶树乳管中与14-3-3蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究14-3-3蛋白在橡胶树乳管中的功能和天然橡胶生物合成调节的分子机制打下了基础。本研究构建了3个巴西橡胶树14-3-3蛋白基因（HbGF14α、HbGF14b、HbGF14c）的酵母双杂交诱饵载体。诱饵载体自激活检测表明三个诱饵载体无白激活性；毒性检验表明诱饵载体表达蛋白质对酵母菌无毒害作用。诱饵载体可以用于酵母双杂交实验。构建了巴西橡胶树胶乳cNDA酵母双杂交文厍。成功转化单菌落个数为4.6×106；浓缩后每毫升菌悬液中含有细胞数为2.72×109；文库滴度为1.32×107。诱饵载体与文库杂交,通过营养缺陷筛选、单独与诱饵载体共转验证,共得到25个阳性cDNA克隆。经Blantx分析,这些cDNA编码蛋白按功能分成胶乳代谢、氧化应激、蛋白/DNA/RNA结合蛋白、信号蛋白、碳水化合物代谢、蛋白酶体相关蛋白、未知蛋白七大类。实验数据分析表明HbGF14a可能通过与转录因子HbRZF的相互作用来调控天然橡胶的生物合成,HbGF14b可能通过与橡胶小粒子蛋白的直接作用参与天然橡胶的生物合成的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 天然橡胶生物合成
• 1.2 14-3-3蛋白
• 1.2.1 14-3-3蛋白的亚细胞定位
• 1.2.2 14-3-3蛋白在植物中的作用
• 1.3 研究蛋白质间相互作用的技术
• 1.3.1 酵母双杂交技术的研究进展
• 1.3.2 酵母双杂交系统的组成及操作过程
• 1.3.3 酵母双杂交系统的优缺点
• 1.3.4 酵母双杂交技术的发展和衍生
• 1.3.5 酵母双杂交技术的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 本研究总的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 试剂
• 2.2 酵母双杂交诱饵载体的构建及诱饵载体的自激活与毒性检验
• 2.2.1 HbGF基因的扩增
• 2.2.2 PCR产物的回收
• 2.2.3 目的片断与pMD19-T连接及其重组子的筛选
• 2.3 14-3-3蛋白基因的诱饵载体的构建
• 2.3.1 加酶切位点的引物设计与合成
• 2.3.2 诱饵载体的构建与鉴定
• 2.4 酵母双杂交诱饵载体的检测
• 2.4.1 酵母菌株表型的鉴定
• 2.4.2 酵母双杂交阴阳性对照实验
• 2.4.3 诱饵载体的自激活检验
• 2.4.4 诱饵载体的毒性检验
• 2.4.5 3-AT抑制浓度的筛选
• 2.5 酵母双杂交文库的构建
• 2.5.1 链cDNA的纯化
• 2.5.2 文库的构建
• 2.6 诱饵载体与表达文库的杂交及阳性克隆的筛选
• 2.6.1 诱饵载体与表达文库的杂交
• 2.6.2 文库滴度检验
• 2.6.3 文库杂交镜检
• 2.6.4 杂交率的计算
• 2.6.5 阳性克隆的筛选及验证
• 3 结果与分析
• 3.1 诱饵蛋白基因的克隆和诱饵载体的构建与鉴定
• 3.2 诱饵载体的自激活检测
• 3.3 3-AT抑制浓度的筛选
• 3.4 诱饵载体的毒性检测
• 3.5 链cDNA的纯化
• 3.6 文库质量的鉴定
• 3.7 文库杂交镜检
• 3.8 杂交率的计算
• 3.9 阳性克隆的筛选
• 3.10 阳性克隆的共转化验证
• 4 讨论
• 4.1 阳性克隆的功能分析
• 4.2 14-3-3蛋白与天然橡胶生物合成
• 4.3 酵母双杂交的假阴性和假阳性问题
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢