转PtDRG01基因烟草的抗病试验与表达研究

论文摘要

PtDRG01基因是根据抗病基因NBS/LRR区域的保守性,由毛白杨抗病无性系中克隆得到的基因,经生物信息学分析,证实该基因与杨树的许多抗病基因高度同源,但仍然有必要对该基因进行功能鉴定。本研究旨在以转PtDRG01基因的烟草为实验材料,对转化烟草进行抗病试验和表达分析,从而鉴定该基因的功能,为将来开展该基因的抗病机理和基因工程研究奠定基础。本研究以先前获得的阳性转PtDRG01基因烟草无性系TG-01TG-23为实验材料,对23个阳性转化株系进行烟草花叶病毒的接种试验,表型观察结果发现,在接种病毒1周和6周后,转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。对接种病毒后的转基因株系进行PtDRG01基因表达的定量分析和烟草花叶病毒的定量分析,荧光定量PCR结果显示,TG-11叶片中的TMV数量显著低于非转基因植株,且该株系中PtDRG01基因的转录水平明显高于非转基因植株。这些结果表明,毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能,其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。进而以高效抗病株系TG-11为试验材料,对接种病毒后植株体内过氧化氢酶的活性以及病程相关蛋白基因PR-1的表达进行了分析,结果表明:接种病毒后抗病株系TG-11中过氧化氢酶活性的降低幅度明显大于非转基因植株,且TG-11中过氧化氢酶活性显著低于非转基因植株,过氧化氢酶活性的大幅降低,在一定程度上说明过氧化氢含量的增多,从而推测在PtDRG01基因介导的抗病反应中,过氧化氢作为一种信号分子发挥作用;与非转基因植株相比,抗病株系TG-11在接种病毒后,PR-1的表达量显著较高。一方面说明PR-1作为防卫基因,参与了PtDRG01基因介导的烟草抗TMV反应;另一方面由于PR-1基因为水杨酸的Marker基因,其高效表达也说明了水杨酸含量的增多,从而可证明水杨酸在抗病反应中的信号分子作用。另外本研究还对抗病株系TG-11的自交T1代进行了PtDRG01基因的PCR检测,PCR结果经卡方检验分析,自交后代分离比例符合3:1,说明外源基因能够稳定遗传至下一代。上述研究鉴定了PtDRG01基因的抗病功能,找到了该基因介导的烟草抗病反应其中的两个信号分子,证明了TG-11抗病株系中PtDRG01基因的遗传稳定性。通过上述研究,可为将来开展PtDRG01基因抗叶锈病的功能鉴定、PtDRG01基因在毛白杨中抗病机理的研究、以及PtDRG01基因的基因工程研究奠定基础,并且可为其他TIR-NBS-LRR型抗病基因的功能鉴定及抗病机理研究提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 植物抗病反应与抗病R 基因的研究概况
• 1.1.1 抗病R 基因的结构与分类
• 1.1.2 R 蛋白与Avr 蛋白的作用方式
• 1.1.3 抗病防御反应
• 1.1.4 抗病信号传导
• 1.2 植物抗病R 基因的克隆
• 1.3 植物抗病R 基因同源序列的研究与应用
• 1.3.1 植物抗病基因同源序列的研究现状
• 1.3.2 植物抗病基因同源序列的应用
• 2 研究思路与技术路线
• 3 转 PtDRG01 基因烟草的抗病试验及其表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 烟草花叶病毒的接种
• 3.1.3 总RNA 的提取与cDNA 的制备
• 3.1.4 实时荧光定量PCR
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 接种病毒后烟草的表型观察
• 3.2.2 烟草中PtDRG01 基因表达的定量分析
• 3.2.3 烟草中病毒的定量分析
• 3.3 讨论
• 4 PtDRG01 基因抗病信号传导途径的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料的制备
• 4.1.2 过氧化氢酶活性的测定
• 4.1.3 病程相关蛋白表达的定量分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 过氧化氢酶活性变化
• 4.2.2 病程相关蛋白的表达分析
• 4.3 讨论
• 5 转基因株系中 PtDRG01 基因遗传稳定性分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 自交种子苗的获得
• 5.1.2 种子苗的DNA 提取与PCR 检测
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 6 结论与研究展望
• 6.1 结论
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢