广西6株狂犬病分离毒株P和M基因的克隆和序列分析

论文摘要

为了探讨广西狂犬病病毒在分子水平上的变异规律,本试验应用RT-PCR技术,通过NSM1/NSM2引物,对6个广西毒株GXNN2、GXPL、GXPXD、GXQZD、GXYZD和GXNND的P和M基因进行扩增、克隆和测序。将克隆的P和M基因ORF的核苷酸及其推导的氨基酸序列,与本实验室已测定的23株及国内外公开发表的16株狂犬病病毒相应序列进行同源性和遗传进化树分析。结果显示,不管基于P基因还是M基因,进化树分析表明,广西狂犬病分离毒株都可分为3个群:Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。Ⅰ群包括GXHX82、GXHXB、GXLC9、GXQZD、GX08、GXNND、GXHX、GX014、GX195、GXLB、GXSL、GXWXp、GX260、GX01、GX09、GX091和GXLA共17株,Ⅱ群包括GXLCC、GXPL、GXYZD、GXBM、GX219、GX304、GXLA11、GXNN2、GX074、GXPX和GXPXD共11株,Ⅲ群仅有GXN119株。本次克隆的6个毒株中,GXQZD和GXNND株属于Ⅰ群,GXPL、GXYZD、GXNN2和GXPXD属于Ⅱ群。同源性分析表明,本次克隆的6个毒株P基因编码区核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别在85.8%—99.6%和91.2%—99.7%之间;M基因的分别在89.7%—100%和96%—100%之间。此6株与之前测序的23个广西毒株P基因编码区核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别在85%—100%和90.2%—100%之间,M基因的分别在88.5%—100%和95.5%—100%之间。比较的P基因和M基因的氨基酸特异位点,结果发现,广西毒株P基因氨基酸第69、70、130和131位属于Ⅰ群毒株特异性位点;第134、135、140和151位为Ⅱ群毒株特异性位点;第73、162、167、174、240、253和281位为Ⅲ群特异性位点;第90位为广西Ⅰ、Ⅱ群共有的特异性位点;第57,63和241位属于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群毒株共有的特异性位点;广西毒株M基因氨基酸第17和20位属于Ⅱ群毒株特异性位点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 狂犬病病原
• 1.2 病毒磷蛋白和基质蛋白研究进展
• 1.2.1 磷蛋白（Phosphoprotein,P蛋白）
• 1.2.2 基质蛋白（Matrix Protein,M蛋白）
• 1.3 狂犬病病毒的复制和转录及其调控
• 1.4 立题的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株、菌种与质粒
• 2.1.2 RNA提取试剂及各种酶类
• 2.1.3 其他试剂
• 2.1.4 质粒提取的溶液配制
• 2.1.5 培养细菌所用试剂
• 2.1.6 仪器
• 2.1.7 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 ERA疫苗株与脑组织的处理
• 2.2.2 病毒RNA的提取
• 2.2.3 反转录
• 2.2.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.5 PCR产物电泳与分析
• 2.2.6 PCR产物胶回收
• 2.2.7 连接pMD18-T
• 2.2.8 感受态细胞制备
• 2.2.9 转化与培养
• 2.2.10 质粒的抽提
• 2.2.11 重组质粒的鉴定
• 2.2.12 测序与序列分析
• 第三章 结果
• 3.1 脑组织的狂犬病阳性鉴定结果
• 3.2 含P和M基因片段的RT-PCR扩增结果
• 3.3 重组质粒双酶切鉴定结果
• 3.4 重组质粒PCR鉴定结果
• 3.5 测序结果
• 3.6 P基因的分析
• 3.6.1 P基因编码区核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较分析
• 3.6.2 P基因遗传进化树
• 3.7 M基因比较分析
• 3.7.1 M基因核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较分析
• 3.7.2 M基因遗传进化树
• 第四章 讨论
• 4.1 基因克隆
• 4.2 P基因的比较
• 4.3 M基因比较
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢