腺病毒介导HBV载体表达双靶位shRNA抑制HBV转基因小鼠体内HBV表达的研究

论文摘要

目的:慢性乙型病毒性肝炎是我国的常见病,迄今尚无满意疗法。基因疗法为乙型肝炎提供了新的治疗策略。RNA干扰（RNA interference , RNAi）技术是指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的,细胞内mRNA发生特异性降解,并导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象。RNAi针对乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus , HBV）基因具有强效的沉默功能,但尚缺乏理想的向细胞内转运的工具,本研究应用腺病毒载体转导HBV载体表达发夹状RNA（short hairpin RNA , shRNA ）,在HBV转基因小鼠体内利用野生型HBV为之提供包装,分泌抗HBV的HBV样颗粒,实现导向型及放大效应,有望为发展特异性的抗HBV基因治疗提供新的技术平台。方法:应用AdMaxTM腺病毒载体系统,将HBV载体表达双靶位shRNA的质粒- pdp3ssx2m-203H1sh6-1715U6sh8插入腺病毒载体,构建了重组腺病毒Ad-CH-sh68及对照载体Ad-CH-RFP2,转染293细胞,大量扩增后用氯化铯密度梯度纯化法纯化,测重组腺病毒滴度。后将重组腺病毒感染HBV转基因小鼠,30只HBV转基因小鼠随机分为3组:实验组、阴性对照组和空白对照组,每组分别为10只。实验组小鼠经尾静脉注射Ad-CH-sh68,阴性对照组经尾静脉注射Ad-CH-RFP2,空白对照组注射生理盐水。感染重组腺病毒Ad-CH-RFP2后4、12、20天观察小鼠体内红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein, RFP）的表达。在感染0、4、8、12、16、20天分别观察shRNA对HBV的抑制效应。应用MEIA进行病毒蛋白定量检测,免疫组织化学检测HBV特定蛋白的表达,荧光定量PCR检测HBV-DNA,还同时检测了组织病理学变化。将治疗组和阴性对照组小鼠血清中提取HBV-DNA,做PCR扩增观察体内是否形成重组HBV。结果:1成功设计并构建了重组腺病毒Ad-CH-sh68和对照载体Ad-CH-RFP2,在293细胞内大量扩增后,氯化铯密度梯度纯化法纯化后测的浓度分别为1.23×1013、4.73×1012病毒颗粒（viral particles, vp）/mL。2重组腺病毒经尾静脉感染HBV转基因小鼠后,小鼠一般情况良好,在实验期间均未出现死亡。实验组和阴性对照组小鼠肝脏病理HE染色结果显示感染腺病毒后12天肝细胞出现轻度肿胀,局部有淋巴细胞浸润,后恢复正常。3阴性对照组小鼠在感染Ad-CH-RFP2后4天肝脏为粉红色,冰冻切片观察RFP表达量结果显示重组腺病毒能有效感染HBV转基因小鼠,感染后4天大部分的肝细胞表达RFP,随时间推移荧光表达量下降。4 shRNA抑制HBV转基因小鼠体内HBV-DNA的复制:三组小鼠血清提取DNA后,经荧光定量PCR检测,结果显示shRNA对血清内的HBV-DNA有显著的抑制作用,重组腺病毒AD-HBV-sh68感染后4天开始下降,感染后20天对HBV-DNA的抑制高达约2log10数量级,效果优于对体内HBV特定蛋白表达的抑制。与空白对照组相比差别有显著意义（P<0.001）,与阴性对照组相比差别也有显著意义（P<0.001）,阴性对照组与空白对照组相比无意义。治疗组20天与0天相比差别有意义（p<0.001）,阴性对照组、空白对照组均无意义（p>0.05）。5 shRNA对HBV转基因小鼠体内表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）的抑制作用:通过对三组小鼠血清中HBsAg定量的检测,观察shRNA对HBV基因表达的抑制效果。注射重组腺病毒AD-HBV-sh68后,在治疗不同时间定量检测小鼠血清中的HBsAg,结果发现在感染后4天开始下降,至20天降于一低水平表达,抑制率为67.39%。腺病毒的转染率和HBsAg半衰期较长对抑制率也有影响。与空白对照组相比差别有显著意义（P<0.001）,与阴性对照组相比差别也有显著意义（P<0.001）,阴性对照组与空白对照组相比无意义。治疗组20天与0天相比差别有意义（p<0.001）,阴性对照组、空白对照组均无意义（p>0.05）。6 HBV转基因小鼠肝脏内表面抗原（HBsAg）和核心抗原（hepatitis B core antigen ,HBcAg）免疫组织化学:HBsAg与HBcAg主要呈核浆型分布,少部分在胞浆内表达。空白对照组HBV转基因小鼠肝细胞胞核内有大量棕褐色颗粒（HBsAg）,阴性对照组小鼠内棕色颗粒数较空白对照组略有下降,治疗组小鼠在感染重组腺病毒4、12天时棕色颗粒数所占比例明显降低,感染20天体内只有少量棕色颗粒表达。HBcAg在三组的表达情况类似于HBsAg,治疗组在感染20天只有很少的阳性颗粒表达,阴性对照组较空白对照组略有下降。7 HBV转基因小鼠体内重组HBV形成:HBV转基因小鼠血清PCR结果证明了HBV载体在野生型HBV辅助下能够形成重组HBV,且随着载体质粒比例的增大,重组载体也增加。结论:本研究应用腺病毒载体转导HBV载体表达shRNA,经尾静脉注射感染HBV转基因小鼠,实验结果表明shRNA能有效且较长时间的抑制小鼠体内HBV基因的复制和表达。尽管把HBV载体插入腺病毒载体,利用腺病毒感染HBV转基因小鼠,能有效的将shRNA转入小鼠肝脏细胞中,但走向临床,仍需不断的全方面研究。总之,本研究结果为RNAi技术治疗HBV的慢性感染提供了重要的实验数据,为进一步深入研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 腺病毒介导HBV 载体表达双靶位 shRNA 抑制HBV 转基因小鼠体内HBV 表达的研究
• 第一部分 腺病毒介导HBV 载体表达双靶位 shRNA 的构建及表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 shRNA 对HBV 转基因小鼠体内HBV 的抑制作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一 siRNA 技术及抑制HBV 复制的研究进展
• 综述二 乙型肝炎病毒动物模型的研究现状
• 致谢
• 个人简历