本文主要研究内容
作者李明（2019）在《CSBV重组结构蛋白抗原性研究和双抗夹心ELISA试剂盒研制》一文中研究指出：中华蜜蜂囊状幼虫病(Chinese Sacbrood Disease,CSBD),是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese Sacbrood Virus,CSBV)引起的一种高致病性、高传染性的病毒性疾病,俗称为“蜂癌”,可以造成蜜蜂幼虫的大量死亡。然而,目前还没有合适的包括CSBV在内的蜜蜂病毒培养体系,这极大地限制了CSBV的研究和防治。在CSBV的检测上,症状诊断不够确切,电镜观察和血清学检测费力耗时,尤其是很难获得CSBV标准阳性血清,使得通过免疫学方法对CSBV进行检测的研究鲜有报道,而分子生物学诊断则面临需要特殊实验设备、成本较高等问题,只能用于实验室检测,无法大面积推广。鉴于此,本研究以本实验室分离到的CSBV基因为基础,分别以优化改造后用Linker连接的VP1、VP2基因和优化后的连续编码VP2、VP4和VP1整段基因为靶基因,进行原核表达,并用纯化的表达蛋白免疫小鼠和鸡,比较这两个表达蛋白的抗原性,筛选出抗原性较好的蛋白代替CSBV作为免疫原,制备单克隆抗体。利用制备的单克隆抗体研制双抗体夹心ELISA检测试剂盒,并对试剂盒的性能进行检测。具体研究内容如下:1.目的蛋白抗原性比较。以本实验室分离到的CSBV的基因序列(Genbank:KU574661.1)为基础进行优化及密码子改造,人工合成Opti VP1和Opti VP2。利用融合PCR方法,用刚性肽做为Linker和优化后的VP4基因,获得目的基因VP2-P-VP1和VP2-VP4-VP1。将这两个基因构建到pET28a载体上,并进行诱导表达。用CSBV、PBS和纯化后的两种重组结构蛋白分别免疫小鼠,检测血清效价和淋巴细胞增殖指数。发现VP2-P-VP1组比VP2-VP4-VP1组略高,差异不显著(P>0.05),这两组都明显高于PBS组,但都低于CSBV组,与CSBV组差异显著(P<0.05)。用这两种蛋白免疫鸡,检测IgY抗体效价,发现均能诱导产生IgY,都低于CSBV组,且VP2-P-VP1组的IgY效价略高于VP2-VP4-VP1组。通过病毒中和试验,发现这两组产生的IgY均具有病毒中和能力。说明VP2-P-VP1和VP2-VP4-VP1蛋白都具有较好的抗原性,其中VP2-P-VP1的抗原性略高一些,可以作为免疫原,代替CSBV,用于生物制剂的研发。2.抗CSBV单克隆抗体制备。用纯化的VP2-P-VP1蛋白免疫小鼠,制备单抗。共筛选到8个阳性细胞株,1E2、2E7、3B12、4B1、4G1、4D4、4F4和5D5,连续传代10次,分泌的抗体效价均较稳定。将这8株细胞注射入小鼠腹腔,制备腹水,效价均达到16000以上,其中4F4、5D5的效价达到了64000。亚型鉴定,2E7、3B12、4B1、4D4是IgG1,4G1、4F4是IgG2a,1E2、5D5是IgG2b。将腹水纯化,进行SDS-PAGE分析,明显可以看到55 kD的重链条带和25 kD的轻链条带,并且杂蛋白很少,纯化效果较好。用VP1纯化蛋白和VP2纯化蛋白分别包板进行ELISA检测,1E2、2E7、3B12、4B1、5D5的结合位点在VP1上,而4G1、4D4和4F4的结合位点在VP2上。ELISA检测单抗的特异性,发现单抗都只与CSBV反应,不与其他病毒反应,说明制备的单抗都具有较好的特异性。进行中和试验,4F4组和5D5组与PBS对照组中的死亡率差异不显著(P>0.05),与CSBV组的差异显著(P<0.05)。而其余6组,死亡率与CSBV组差异不显著(P>0.05),说明4F4和5D5对CSBV存在中和作用,可以用于CSBV的防治。3.双抗夹心ELISA检测试剂盒的研制。进行配对实验,发现1E2和5D5配对效果最佳。用棋盘法确定1E2的最佳包被浓度为3.75μg/mL,HRP标记5D5的最佳稀释浓度为1:2000,再对捕获抗体的包被时间、封闭液及封闭时间、抗原孵育时间、检测抗体孵育时间、显色时间等反应条件进行优化,建立了双抗夹心ELISA检测方法。特异性实验表明,其只与CSBV反应,不与其它蜜蜂病毒发生交叉反应,具有较好的特异性。用该方法检测CSBV病毒,最小检出量为3.675×10~4 copies/μL,具有很好的敏感性。进行批间重复试验和批内重复试验,其变异系数均小于5%,说明该方法具有很好的重复性。取60只蜜蜂幼虫,用双抗夹心ELISA检测方法检测后用RT-PCR方法进行验证。结果显示,双抗夹心ELISA检测方法与RT-PCR方法的阳性符合率为88.9%,阴性符合率为91.7%,总符合率为90%,说明建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的检测效果,可以用于临床样品检测。参照OIE推荐的“传染病诊断试验的验证原则”,组装试剂盒,经过稳定性检测,该试剂盒的保存期限为12个月。总之,本实验成功表达了VP2-P-VP1和VP2-VP4-VP1蛋白,通过比较,选择抗原性较好的VP2-P-VP1蛋白制备了8株单克隆抗体,这8株抗体中有两株具有病毒中和能力,可以用于抗CSBV生物制剂的研发。成功研制了具有较高特异性、敏感性和准确性的双抗夹心ELISA检测试剂盒,该试剂盒可以用于CSBV的临床检测,为CSBV的快速诊断、实时监测和早期预警提供了技术支持。
Abstract
zhong hua mi feng nang zhuang you chong bing (Chinese Sacbrood Disease,CSBD),shi you zhong hua mi feng nang zhuang you chong bing du (Chinese Sacbrood Virus,CSBV)yin qi de yi chong gao zhi bing xing 、gao chuan ran xing de bing du xing ji bing ,su chen wei “feng ai ”,ke yi zao cheng mi feng you chong de da liang si wang 。ran er ,mu qian hai mei you ge kuo de bao gua CSBVzai nei de mi feng bing du pei yang ti ji ,zhe ji da de xian zhi le CSBVde yan jiu he fang zhi 。zai CSBVde jian ce shang ,zheng zhuang zhen duan bu gou que qie ,dian jing guan cha he xie qing xue jian ce fei li hao shi ,you ji shi hen nan huo de CSBVbiao zhun yang xing xie qing ,shi de tong guo mian yi xue fang fa dui CSBVjin hang jian ce de yan jiu xian you bao dao ,er fen zi sheng wu xue zhen duan ze mian lin xu yao te shu shi yan she bei 、cheng ben jiao gao deng wen ti ,zhi neng yong yu shi yan shi jian ce ,mo fa da mian ji tui an 。jian yu ci ,ben yan jiu yi ben shi yan shi fen li dao de CSBVji yin wei ji chu ,fen bie yi you hua gai zao hou yong Linkerlian jie de VP1、VP2ji yin he you hua hou de lian xu bian ma VP2、VP4he VP1zheng duan ji yin wei ba ji yin ,jin hang yuan he biao da ,bing yong chun hua de biao da dan bai mian yi xiao shu he ji ,bi jiao zhe liang ge biao da dan bai de kang yuan xing ,shai shua chu kang yuan xing jiao hao de dan bai dai ti CSBVzuo wei mian yi yuan ,zhi bei chan ke long kang ti 。li yong zhi bei de chan ke long kang ti yan zhi shuang kang ti ga xin ELISAjian ce shi ji he ,bing dui shi ji he de xing neng jin hang jian ce 。ju ti yan jiu nei rong ru xia :1.mu de dan bai kang yuan xing bi jiao 。yi ben shi yan shi fen li dao de CSBVde ji yin xu lie (Genbank:KU574661.1)wei ji chu jin hang you hua ji mi ma zi gai zao ,ren gong ge cheng Opti VP1he Opti VP2。li yong rong ge PCRfang fa ,yong gang xing tai zuo wei Linkerhe you hua hou de VP4ji yin ,huo de mu de ji yin VP2-P-VP1he VP2-VP4-VP1。jiang zhe liang ge ji yin gou jian dao pET28azai ti shang ,bing jin hang you dao biao da 。yong CSBV、PBShe chun hua hou de liang chong chong zu jie gou dan bai fen bie mian yi xiao shu ,jian ce xie qing xiao jia he lin ba xi bao zeng shi zhi shu 。fa xian VP2-P-VP1zu bi VP2-VP4-VP1zu lve gao ,cha yi bu xian zhe (P>0.05),zhe liang zu dou ming xian gao yu PBSzu ,dan dou di yu CSBVzu ,yu CSBVzu cha yi xian zhe (P<0.05)。yong zhe liang chong dan bai mian yi ji ,jian ce IgYkang ti xiao jia ,fa xian jun neng you dao chan sheng IgY,dou di yu CSBVzu ,ju VP2-P-VP1zu de IgYxiao jia lve gao yu VP2-VP4-VP1zu 。tong guo bing du zhong he shi yan ,fa xian zhe liang zu chan sheng de IgYjun ju you bing du zhong he neng li 。shui ming VP2-P-VP1he VP2-VP4-VP1dan bai dou ju you jiao hao de kang yuan xing ,ji zhong VP2-P-VP1de kang yuan xing lve gao yi xie ,ke yi zuo wei mian yi yuan ,dai ti CSBV,yong yu sheng wu zhi ji de yan fa 。2.kang CSBVchan ke long kang ti zhi bei 。yong chun hua de VP2-P-VP1dan bai mian yi xiao shu ,zhi bei chan kang 。gong shai shua dao 8ge yang xing xi bao zhu ,1E2、2E7、3B12、4B1、4G1、4D4、4F4he 5D5,lian xu chuan dai 10ci ,fen bi de kang ti xiao jia jun jiao wen ding 。jiang zhe 8zhu xi bao zhu she ru xiao shu fu qiang ,zhi bei fu shui ,xiao jia jun da dao 16000yi shang ,ji zhong 4F4、5D5de xiao jia da dao le 64000。ya xing jian ding ,2E7、3B12、4B1、4D4shi IgG1,4G1、4F4shi IgG2a,1E2、5D5shi IgG2b。jiang fu shui chun hua ,jin hang SDS-PAGEfen xi ,ming xian ke yi kan dao 55 kDde chong lian tiao dai he 25 kDde qing lian tiao dai ,bing ju za dan bai hen shao ,chun hua xiao guo jiao hao 。yong VP1chun hua dan bai he VP2chun hua dan bai fen bie bao ban jin hang ELISAjian ce ,1E2、2E7、3B12、4B1、5D5de jie ge wei dian zai VP1shang ,er 4G1、4D4he 4F4de jie ge wei dian zai VP2shang 。ELISAjian ce chan kang de te yi xing ,fa xian chan kang dou zhi yu CSBVfan ying ,bu yu ji ta bing du fan ying ,shui ming zhi bei de chan kang dou ju you jiao hao de te yi xing 。jin hang zhong he shi yan ,4F4zu he 5D5zu yu PBSdui zhao zu zhong de si wang lv cha yi bu xian zhe (P>0.05),yu CSBVzu de cha yi xian zhe (P<0.05)。er ji yu 6zu ,si wang lv yu CSBVzu cha yi bu xian zhe (P>0.05),shui ming 4F4he 5D5dui CSBVcun zai zhong he zuo yong ,ke yi yong yu CSBVde fang zhi 。3.shuang kang ga xin ELISAjian ce shi ji he de yan zhi 。jin hang pei dui shi yan ,fa xian 1E2he 5D5pei dui xiao guo zui jia 。yong qi pan fa que ding 1E2de zui jia bao bei nong du wei 3.75μg/mL,HRPbiao ji 5D5de zui jia xi shi nong du wei 1:2000,zai dui bu huo kang ti de bao bei shi jian 、feng bi ye ji feng bi shi jian 、kang yuan fu yo shi jian 、jian ce kang ti fu yo shi jian 、xian se shi jian deng fan ying tiao jian jin hang you hua ,jian li le shuang kang ga xin ELISAjian ce fang fa 。te yi xing shi yan biao ming ,ji zhi yu CSBVfan ying ,bu yu ji ta mi feng bing du fa sheng jiao cha fan ying ,ju you jiao hao de te yi xing 。yong gai fang fa jian ce CSBVbing du ,zui xiao jian chu liang wei 3.675×10~4 copies/μL,ju you hen hao de min gan xing 。jin hang pi jian chong fu shi yan he pi nei chong fu shi yan ,ji bian yi ji shu jun xiao yu 5%,shui ming gai fang fa ju you hen hao de chong fu xing 。qu 60zhi mi feng you chong ,yong shuang kang ga xin ELISAjian ce fang fa jian ce hou yong RT-PCRfang fa jin hang yan zheng 。jie guo xian shi ,shuang kang ga xin ELISAjian ce fang fa yu RT-PCRfang fa de yang xing fu ge lv wei 88.9%,yin xing fu ge lv wei 91.7%,zong fu ge lv wei 90%,shui ming jian li de shuang kang ga xin ELISAjian ce fang fa ju you hen hao de jian ce xiao guo ,ke yi yong yu lin chuang yang pin jian ce 。can zhao OIEtui jian de “chuan ran bing zhen duan shi yan de yan zheng yuan ze ”,zu zhuang shi ji he ,jing guo wen ding xing jian ce ,gai shi ji he de bao cun ji xian wei 12ge yue 。zong zhi ,ben shi yan cheng gong biao da le VP2-P-VP1he VP2-VP4-VP1dan bai ,tong guo bi jiao ,shua ze kang yuan xing jiao hao de VP2-P-VP1dan bai zhi bei le 8zhu chan ke long kang ti ,zhe 8zhu kang ti zhong you liang zhu ju you bing du zhong he neng li ,ke yi yong yu kang CSBVsheng wu zhi ji de yan fa 。cheng gong yan zhi le ju you jiao gao te yi xing 、min gan xing he zhun que xing de shuang kang ga xin ELISAjian ce shi ji he ,gai shi ji he ke yi yong yu CSBVde lin chuang jian ce ,wei CSBVde kuai su zhen duan 、shi shi jian ce he zao ji yu jing di gong le ji shu zhi chi 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自东北农业大学的李明，发表于刊物东北农业大学2019-08-27论文，是一篇关于中华蜜蜂论文,中蜂囊状幼虫病毒论文,结构蛋白论文,单克隆抗体论文,双抗夹心检测试剂盒论文,东北农业大学2019-08-27论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自东北农业大学2019-08-27论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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