橡胶树ADF基因克隆、表达及功能分析

论文摘要

肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor,ADF）是一种具有调节肌动蛋白解聚和聚合作用的肌动蛋白结合蛋白,通过调节细胞内G-actin和F-actin之间的动态平衡来影响细胞骨架的功能。已有研究结果表明,橡胶树乳管细胞骨架与橡胶树产排胶有关,而强割、强乙烯刺激导致橡胶树产排胶失衡,最终造成橡胶树死皮。橡胶树ADF基因的克隆、表达模式及功能研究对揭示ADF基因在橡胶树产排胶及死皮发生中的作用具有重要意义。目前,对于ADF的研究主要集中在棉花、拟南芥等植物,而对橡胶树ADF的研究相对较少。本研究以巴西橡胶树热研8-79为实验材料,采用RACE技术从胶乳中克隆到两个ADF基因（HbADF1和HbADF2）。进一步对HbADFl和HbADF2进行生物信息学、表达模式及功能分析,获得主要研究结果如下：（1）通过抑制消减杂交筛选到ADF基因片段,采用RACE技术从橡胶树胶乳中克隆到两个ADF基因：HbADF1全长cDNA为888bp,包含420bp的开放阅读框,5′非翻译区长105bp,3′非翻译区长363bp。该基因编码139个氨基酸,分子量约为16kD;HbADF2全长cDNA为656bp,包含420bp的完整的开放阅读框,5′非翻译区长41bp,3′非翻译区长195bp,该基因同样编码139个氨基酸,分子量约为16kD。获得了HbADF2的基因组序列,序列分析显示HbADF2包含3个外显子和2个内含子；利用Genome Walking方法获得936bp的HbADF2启动子序列,该启动子序列中含有两个典型的真核生物核心启动子区域和多种顺式调控元件,部分顺式作用元件可能与HbADF2在逆境条件下的表达模式有关。（2）保守结构域分析结果表明HbADF1和HbADF2均含有ADF保守结构域,具有磷酸化位点、肌动蛋白和纤维状肌动蛋白结合位点。进化树分析显示植物ADF蛋白分为4个亚类,HbADF1和HbADF2与拟南芥ADF1-4、矮牵牛ADF1-2划为一个亚类,拟南芥该类基因为组成性表达。生物信息学分析结果表明HbADF1和HbADF2的N端无信号肽,可能定位在胞质中；两者均为亲水性、不稳定蛋白。HbADF1和HbADF2氨基酸的相似性达到91%,二级结构中均含有α-螺旋和β-折叠,除C端和N端二级结构存在明显不同外,HbADF1和HbADF2中间部分基本相同。（3）利用半定量RT-PCR分析两个基因在不同组织、叶片不同发育时期、死皮和健康及不同处理条件下的表达模式,结果显示HbADFl和HbADF2为组成型表达,但在不同组织中存在差异,且两基因均在叶中表达最高,接下来是胶乳、花和树皮。在叶片不同发育时期,两个基因表达存在变化。HbADF1表达随叶片发育进程逐渐升高,淡绿期表达量最高,之后不断降低；HbADF2则在衰老期表达量最高,变色期最低。乙烯和茉莉酸均调控HbADF表达,HbADF1表达随乙烯处理时间逐渐升高,48h达到最大值,之后基本不变；茉莉酸处理表现为先升高后下降趋势,4h达到最大值,之后逐渐下降,48h低于处理前水平。HbADF2表达随乙烯处理时间逐渐升高,24h达到最大值,之后基本不变。在茉莉酸处理下,HbADF2表达变化先升高后下降。此外,1bADFl和HbADF2在伤害和微丝解聚剂KI处理条件下表达模式基本相同,随处理时间延长表达量上升。在干旱和低温处理下,HbADF1和HbADF2表达变化不明显。（4）构建了真核表达载体pESP-HbADF1和pESP-HbADF2,将载体转化酵母菌株SP-Q01,诱导和抑制融合蛋白SDS-PAEG分析结果表明HbADF1和HbADF2编码的蛋白均可在酵母菌株SP-Q01中表达。（5）将HbADF2基因在酵母中过量表达,可导致转基因酵母细胞伸长。DAPI染色发现酵母细胞出现双核,甚至四核现象。推测HbADF2过量表达影响酵母细胞肌动蛋白环形成,胞质分裂受阻,但酵母细胞核可正常分裂,从而出现细胞伸长和多核现象。本研究首次克隆两个橡胶树肌动蛋白解聚因子基因（HbADF1和HbADF2）,对HbADF1和HbADF2进行生物信息学、表达模式及功能分析,为深入研究HbADF1和HbADF2功能及在产排胶和死皮中的作用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 微丝骨架的结构及功能
• 1.1.1 球状肌动蛋白与纤维状肌动蛋白
• 1.1.2 微丝的装配过程
• 1.1.3 微丝骨架的功能
• 1.2 橡胶树中乳管细胞骨架的功能
• 1.3 植物肌动蛋白解聚因子（ADF）研究进展
• 1.3.1 ADF基因结构及蛋白结构
• 1.3.2 ADF在植物体内的生物学功能
• 1.4 细胞中肌动蛋白的观察方法
• 1.4.1 重酶解肌球蛋白法
• 1.4.2 荧光标记法
• 1.4.3 发光蛋白的应用
• 1.4.4 免疫印迹法
• 1.4.5 Lifeact荧光探针标记法
• 1.5 外源基因表达系统
• 1.5.1 粟酒裂殖酵母的生物学特性
• 1.5.2 粟酒裂殖酵母表达系统
• 1.5.3 昆虫细胞表达系统
• 1.5.4 哺乳动物表达系统
• 1.6 立题依据及研究意义
• 1.7 本项研究的技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及处理
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.1.3 工具酶和生化试剂
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 实验材料总RNA的提取
• 2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.3 ADF基因3'RACE扩增
• 2.2.4 ADF基因5'RACE片段扩增
• 2.2.5 ADF基因cDNA全长扩增
• 2.2.6 HbADF2基因基因组的扩增
• 2.2.7 HbADF2基因的启动子克隆
• 2.2.8 橡胶树ADF基因的半定量RT-PCR表达分析
• 2.2.9 ADF基因的真核表达及转基因酵母的形态观察
• 3 结果与分析
• 3.1 橡胶树总RNA提取的检测
• 3.2 ADF基因3′端和5′端序列的扩增
• 3.3 ADF基因全长cDNA序列的克隆
• 3.4 HBADF2基因的基因组克隆及序列分析
• 3.4.1 HbADF2基因组序列的扩增
• 3.4.2 基因结构分析
• 3.5 HBADF2基因的启动子克隆
• 3.5.1 基因组DNA质量检测
• 3.5.2 基因组DNA的消化
• 3.5.3 HbADF2基因启动子的克隆
• 3.6 橡胶树ADF基因的生物信息学分析
• 3.6.1 氨基酸序列比对及功能结构域分析
• 3.6.2 系统进化树分析
• 3.6.3 氨基酸理化特性预测分析
• 3.6.4 亚细胞定位及信号肽预测
• 3.6.5 HbADF2启动子区分析
• 3.7 橡胶树ADF基因的表达特征分析
• 3.7.1 激素处理（ET、JA）下ADF基因表达模式分析
• 3.7.2 叶片不同发育时期和不同组织中ADF基因的表达的分析
• 3.7.3 逆境条件下ADF基因表达模式分析
• 3.7.4 ADF基因在健康和死皮树中的表达模式分析
• 3.8 橡胶树ADF2基因在酵母中的功能分析
• 3.8.1 酵母表达载体构建
• 3.8.2 酵母表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.8.3 过表达HbADF2基因酵母的表型分析
• 4. 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 4.2.1 基因结构功能分析
• 4.2.2 基因的表达模式分析
• 4.2.3 ADF的功能
• 参考文献
• 附录
• 致谢