植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因克隆及其异源表达

论文摘要

乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH, EC1.1.1.27）又称NAD氧化酶,是生物体内糖酵解过程中一个重要的氧化还原酶,催化丙酮酸到乳酸的可逆转化,广泛存在于动物组织、细菌和植物中。同时也是常用的临床医用诊断用酶。因此,对该酶的研究具有广阔的应用前景。本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为研究材料,应用分子生物学技术克隆ldh基因,实现了ldh基因在原核生物大肠杆菌（Escherichia coli）和真核生物毕赤酵母（Pichia pastoris X33）中的诱导表达及组成型表达,并对LDH蛋白的性质、诱导表达条件等进行了研究。研究结果如下:（1）采用PCR技术克隆得到了L. plantarum ldh基因,基因片段大小为963 bp,与GenBank AY513726.1 DNA核苷酸序列一致性为99%,氨基酸序列与GenBank ZP 06196423.1的一致性为100%;（2）构建了原核表达载体pET-ldh,经诱导该基因能够在E.coli BL21（DE3）中进行高效表达,诱导出39 kD的特异性融合蛋白,该蛋白在E. coli中的粗酶液的比活为12.3±0.087 U/mg;（3）优化了LDH在E.coli中的诱导表达条件。最佳诱导表达条件为:当OD600为0.8时添加终浓度为10 mmol/L的乳糖诱导,培养温度为16℃,转速为150 r/min时,可溶性LDH的含量最高;（4）研究了酶的最佳反应温度、最佳pH等性质,确定最佳反应温度为45℃,最佳pH为6.5,此时比酶活为19.3±0.056 U/mg;（5）构建了酵母穿梭质粒pPICZ-ldh,应用氯化锂法成功将此重组质粒转入P. pastoris X33中,通过抗性梯度筛选,得到了具有酶活的转化子,实现了该酶在P. pastoris X33中的胞内诱导表达,LDH酶比活为4.83±0.07 U/mg;（6）构建了酵母穿梭质粒pGAPZ-ldh并转化入P. pastoris X33,实现了LDH在P. pastoris X33中组成型分泌表达。在YPD培养基中培养96 h后,LDH能分泌到发酵液中,测定的LDH酶比活为5.94±0.07 U/mg。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 乳酸脱氢酶简介
• 1.2 乳酸脱氢酶的研究背景
• 1.2.1 乳酸脱氢酶的催化特性
• 1.2.2 乳酸脱氢酶的来源
• 1.2.3 LDH 的基因工程研究
• 1.2.4 乳酸脱氢酶的实际应用价值
• 1.3 大肠杆菌表达体系
• 1.3.1 大肠杆菌表达载体
• 1.3.2 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
• 1.4 毕赤酵母表达系统
• 1.4.1 毕赤酵母表达载体
• 1.4.2 外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响因素
• 1.5 课题研究的意义与主要研究内容
• 1.5.1 研究意义
• 1.5.2 研究内容
• 第2章 乳酸脱氢酶基因克隆、原核诱导表达及功能研究
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 菌株及载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）基因组DNA 的提取
• 2.2.2 ldhL 基因扩增
• 2.2.3 ldhL 的纯化回收
• 2.2.4 克隆载体pT-ldh 的构建
• 2.2.5 pET-ldh 原核表达载体的构建
• 2.2.6 在E.coli 中的诱导表达重组乳酸脱氢酶基因
• 2.2.7 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.8 粗酶液的制备
• 2.2.9 蛋白含量的测定
• 2.2.10 LDH 酶活测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 ldh 基因克隆
• 2.3.2 pT-ldh 克隆载体的构建与鉴定
• 2.3.3 原核表达载体pET-ldh 的构建及鉴定
• 2.3.4 SDS-PAGE 分析
• 2.3.5 粗酶液活性测定
• 2.3.6 诱导培养条件的优化
• 2.3.7 LDH 酶性质参数的测定
• 2.4 本章小结
• 第3章 乳酸脱氢酶在毕赤酵母胞内诱导表达
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 菌株及载体
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 ldh 的基因克隆
• 3.2.2 毕赤酵母穿梭载体pPICZ-ldh 的构建
• 3.2.3 毕赤酵母氯化锂转化
• 3.2.4 毕赤酵母基因组DNA 的提取
• 3.2.5 重组酵母的初步鉴定
• 3.2.6 pPICZ-ldh 毕赤酵母重组子的诱导表达
• 3.2.7 重组酵母的参数测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 ldh 基因克隆结果
• 3.3.2 重组载体pPICZ-ldh 的鉴定
• 3.3.3 重组穿梭载体酵母转化结果
• 3.3.4 重组毕赤酵母的PCR 鉴定
• 3.3.5 LDH 蛋白在毕赤酵母中的SDS-PAGE 鉴定
• 3.3.6 LDH 蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定
• 3.4 本章小结
• 第4章 乳酸脱氢酶在毕赤酵母中组成型分泌表达
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 菌株及载体
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 ldh 的基因克隆
• 4.2.2 毕赤酵母穿梭载体pGAPZ-ldh 的构建
• 4.2.3 毕赤酵母电转化
• 4.2.4 重组酵母的初步鉴定
• 4.2.5 pGAPZ-ldh 毕赤酵母重组子的表达及参数测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 ldh 基因克隆结果
• 4.3.2 重组载体pGAPZ-ldh 的鉴定
• 4.3.3 重组穿梭载体酵母转化结果
• 4.3.4 重组毕赤酵母的PCR 鉴定
• 4.3.5 LDH 蛋白在毕赤酵母中的SDS-PAGE 鉴定
• 4.3.6 LDH 蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢