论文摘要
近年来,内皮素（endothelin,ET）在慢性肾衰竭（Chronic renal failure,CRF）中的作用日益受到国内外学者的广泛关注,有许多学者提出血、尿及肾组织中ET水平的高低可以反映CRF病情的严重性,因为CRF患者血、尿及肾组织中ET水平均有不同程度的升高。当肾脏受到各种免疫炎症损害时肾小球系膜细胞（Glomerular mesangial cells,GMCs）、肾小球上皮细胞（Glomerular epithelial cell,GEC）以及肾小球毛细血管内皮细胞（Glomerular vascular endothelial cell,GVEC）产生ET-1增加,同时肾小管上皮细胞分泌ET-1增加,促使肾功能减退,进行性加速肾纤维化。肾纤维化是各种肾脏疾病发展到CRF的共同途径,包括肾小球硬化和肾间质纤维化。因此,深入研究ET在肾小球硬化和肾间质纤维化发生机制中的作用具有重要的意义。“海昆肾喜”是治疗慢性肾衰竭和早期尿毒症的国家二类中药新药,其主要成分是褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan,FPS）。有研究显示,FPS具有多种生物学功能,如降血压、降血脂、降血糖及增强免疫力等作用,本文通过整体动物实验和体外细胞实验,从组织、细胞、蛋白质、基因水平进行研究,旨在探讨该药防治肾纤维化的作用机制。目的:通过建立阿霉素肾病大鼠模型,从整体动物实验研究海昆肾喜是否能够有效的改善肾功能、延缓肾纤维化、进而从器官、组织、细胞、蛋白质、基因水平研究海昆肾喜对ET-1的影响,以期阐明该药防治肾纤维化的作用机制。方法:1.清洁级雄性Wistar大鼠,按体重大小排序,随机分组,手术组大鼠行右侧肾脏切除术,并腹腔注射阿霉素建立动物模型,各治疗组给予相应药物。每周测量大鼠体重,每2周测大鼠24小时尿蛋白。第10周取大鼠血液检测生化指标,同时取大鼠肾脏观察肾组织病理形态学变化并采用肾小球硬化指数及肾小管-间质损伤评分评价各组大鼠肾组织病理改变。2.采用免疫组织化学法,检测大鼠肾组织中ET-1蛋白;原位杂交法,检测肾组织中ET-1mRNA。3.通过LPS刺激GMCs,MTT法检测在12h,24h,48h和60h各不同时相点GMCs的增殖;用RT-PCR法检测ET-1mRNA基因的表达。4.通过LPS刺激GMCs,用免疫组化检测GMCs ET-1蛋白的表达;用western blot检测ET-1的含量。结果:1.海昆肾喜治疗后,大鼠体重明显升高,24h尿蛋白减少,BUN、Scr、Cho、TG明显下降,大鼠肾组织病理改变明显减轻。2.海昆肾喜能够下调阿霉素肾病大鼠肾组织固有细胞胞浆中ET-1蛋白及mRNA的表达,降低肾组织ET-1含量。3.海昆肾喜能够抑制LPS刺激GMCs的增殖,各时相点以大剂量抑制效果最好。RT-PCR实验结果表明,海昆肾喜可显著抑制GMCs ET-1 mRNA基因的表达,并呈剂量依赖关系。4.海昆肾喜能够明显抑制LPS刺激的GMCs分泌ET-1蛋白,并呈剂量依赖关系。结论:1、海昆肾喜可以改善阿霉素肾病大鼠的肾功能,减少尿蛋白,减轻肾脏的病理损伤,并且有剂量依赖关系。2、海昆肾喜抗肾纤维化的作用机理:细胞水平上,海昆肾喜能够抑制GMCs的增殖,这可能是海昆肾喜防治肾小球硬化的作用机制之一;蛋白质水平上,海昆肾喜能够下调肾组织及GMCs胞浆内ET-1蛋白的表达,进而减缓肾纤维化的发生;基因水平上,海昆肾喜能够通过逆转录过程抑制ET-1mRNA基因的表达,进而抑制GMCs的增殖,减少ECM的积聚,从而延缓CRF的发生。