十字花科植物BcMF2和BcMF4同源基因的克隆、表达及其进化关系研究

论文题目: 十字花科植物BcMF2和BcMF4同源基因的克隆、表达及其进化关系研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 蔬菜学

作者: 张弢

导师: 曹家树

关键词: 十字花科植物,基因克隆,原核表达,序列比对,进化分析

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 十字花科作物是我国重要的农作物之一,也是杂种优势利用最为普遍的一类作物。发掘和创建其雄性不育系,用于配制一代杂种在生产实践中具有重要意义。花粉发育相关基因的克隆和分析有助于通过反义技术等阻断与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育植株。同时,由于十字花科植物形态差异大,又有许多中间过渡类型,因而很难对其中的各类物种进行细致分类和进化定位。近年来,随着分子生物学和生物信息学的发展,为从分子水平上研究十字花科植物的物种演化成为可能。本研究以BcMF2和BcMF4基因为研究对象,通过PCR扩增方法对白菜BcMF2和BcMF4基因的基因组全长和cDNA全长进行了克隆、鉴定以及蛋白质结构和功能的预测;以十字花科不同种属的植物为材料进行BcMF2和BcMF4基因同源序列克隆和鉴定,在BcMF2和BcMF4基因同源序列比对的基础上构建分子进化树;探讨不同物种BcMF2和BcMF4基因的进化关系,分析基因结构上的保守性以及在不同物种间的变异,从而了解该基因在十字花科植物中的普遍作用,为更好的研究基因的功能奠定理论基础;同时依据BcMF2和BcMF4基因的同源比对结果,对十字花科植物不同种属的系统发育关系进行了初步研究,尝试探讨BcMF2和BcMF4基因用于物种进化分析的可行性,为十字花科植物的物种进化提供新的分子证据。研究结果如下: （1）通过PCR扩增的方法在‘矮脚黄’白菜核隐性不育两用系（A/B line）中成功克隆了花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2的DNA全长序列和cDNA序列。结果表明,该基因包含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为1266 bp,编码421个氨基酸序列。对推导的氨基酸序列进行分析,发现该序列包含3个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,12个N-豆蔻酰化位点,1个多聚半乳糖醛酸酶活性位点(257RVTCGPGHGLSVGS)等。将BcMF2基因氨基酸序列与数据库中的其他多聚半乳糖醛酸酶基因进行同源序列比对,构建系统进化树,发现该基因具有所有多聚半乳糖醛酸酶基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因聚为一类,进一步证明了该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。（2）首次对多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2的原核表达进行了研究,将BcMF2基因的完整开放阅读框插入到pET-32a（+）原核表达载体上,成功诱导其在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE电泳结果发现在70 kDa处有一条特异条带,除去载体上26 kDa的谷胱甘肽巯基转移酶后,与预期的目的蛋白大小一致。通过对诱导条件的优化发现,IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,30℃下诱导6 h可获得最佳的表达效果。（3）根据白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2的全长序列设计引物,在十字花科植物的11

论文目录:

缩写词

摘要

Abstract

前言

1 文献综述

1.1 植物花粉发育的分子生物学研究进展

1.1.1 植物花粉的发育过程

1.1.2 花粉发育相关基因的克隆与表达

1.1.3 花粉发育的基因工程

1.2 DNA序列分析在植物系统学研究中的应用

1.2.1 进化研究中几个易混淆的概念

1.2.1.1 分子进化与生物进化

1.2.1.2 基因树和物种树

1.2.1.3 相似性和同源性

1.2.2 植物系统进化研究中常用的基因序列

1.2.2.1 核基因组

1.2.2.2 叶绿体基因组

1.2.3 分子进化研究的生物信息学方法

1.2.3.1 基因序列和氨基酸残基序列同源性比对

1.2.3.2 分子系统树的构建

1.2.3.3 分子进化研究中常用分析软件包

1.3 十字花科植物系统演化关系的研究

1.4 植物多聚半乳糖醛酸酶的研究

1.4.1 PG的作用方式和组织定位

1.4.2 不同PG基因家族之间序列的差异性

1.4.3 PG功能的多样性

1.4.3.1 PG与果实成熟

1.4.3.2 PG与器官脱落

1.4.3.3 PG与花粉授粉

1.4.4 PG基因的表达调控及应用

1.5 植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的研究

1.5.1 PGIP的性质

1.5.2 PGIP的结构及分子特征

1.5.3 PGIP基因研究进展

2 白菜花粉发育相关基因BcMF2全长序列的克隆及其序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 植物材料与主要试剂

2.1.2 DNA提取

2.1.3 RNA分离及检测

2.1.4 cDNA的合成

2.1.5 PCR引物设计

2.1.6 PCR扩增及其产物克隆

2.1.7 BcMF2基因全长序列的特征分析

2.2 结果与分析

2.2.1 BcMF2基因DNA全长和cDNA全长的获得

2.2.2 BcMF2基因核苷酸序列分析

2.2.3 BcMF2基因编码蛋白的特征分析

2.2.4 BcMF2基因编码蛋白二级结构预测及疏水性分析

2.2.5 BcMF2与其它植物PG基因的同源比对

2.3 讨论

2.3.1 BcMF2基因全长序列的结构特征分析

2.3.2 BcMF2基因编码蛋白的功能预测

3 BcMF2基因在大肠杆菌中的高效表达

3.1 材料与方法

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 工具酶和试剂

3.1.3 BcMF2基因原核表达载体的构建

3.1.4 在大肠杆菌BL21中诱导BcMF2基因的高效表达

3.1.5 不同浓度IPTG诱导pET-BcMF2的表达

3.1.6 不同诱导时间下pET-BcMF2的表达

3.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物

3.2 结果与分析

3.2.1 用于原核表达的目的片段的PCR扩增和克隆

3.2.2 原核表达载体的构建

3.2.3 BcMF2基因在大肠杆菌BL21中的高效表达

3.3 讨论

4 十字花科植物BcMF2基因同源序列的克隆及系统进化分析

4.1 材料与方法

4.1.1 试验材料

4.1.2 BcMF2同源基因的克隆和测序

4.1.3 BcMF2同源基因的序列差异分析

4.1.4 十字花科植物系统进化分析

4.2 结果与分析

4.2.1 BcMF2同源序列的扩增和克隆

4.2.2 BcMF2同源基因的序列特征分析

4.2.3 BcMF2同源基因的序列比对

4.2.4 序列变异和遗传信息指数

4.2.5 十字花科植物BcMF2同源基因序列的遗传距离分析

4.2.6 根据BcMF2基因同源性分析十字花科植物物种进化关系

4.3 讨论

4.3.1 十字花科植物BcMF2同源基因的分子克隆

4.3.2 不同物种中BcMF2同源基因的序列差异

4.3.3 系统树构建方法的选择

4.3.4 十字花科植物的系统进化分析

5 多聚半乳糖醛酸酶基因家族的比较分析

5.1 材料与方法

5.2 结果分析

5.2.1 多聚半乳糖醛酸酶保守结构域分析

5.2.2 保守的半胱氨酸残基

5.2.3 细菌PG的比较分析

5.2.4 真菌PG的比较分析

5.2.5 植物内切PG与外切PG

5.2.6 PG系统进化树的构建

5.3 讨论

5.3.1 PG蛋白保守性分析

5.3.2 PG蛋白的系统发育分析

6 白菜BcMF4基因的克隆、测序及特征分析

6.1 材料与方法

6.1.1 试验材料

6.1.2 菌株和主要试剂

6.1.3 DNA提取和RNA分离

6.1.4 引物设计与合成

6.1.5 BcMF4基因的PCR扩增

6.1.6 PCR产物的克隆和测序

6.1.7 序列特征分析

6.2 结果与分析

6.2.1 BcMF4基因DNA和cDNA全长的分离及克隆

6.2.2 BcMF4基因的测序结果

6.2.3 利用Blast软件进行序列相似性分析

6.2.4 BcMF4基因蛋白质序列的基本特征分析

6.2.5 编码蛋白功能位点的分析

6.2.6 结构功能域的确定

6.2.7 编码蛋白的二级结构预测及亲／疏水性分析

6.3 讨论

6.3.1 BcMF4核苷酸和蛋白质序列基本性质分析

6.3.2 BcMF4蛋白质的功能预测

7 十字花科植物BcMF4基因同源序列的克隆及进化分析

7.1 材料与方法

7.1.1 试验材料

7.1.2 BcMF4同源基因的克隆和测序

7.1.3 十字花科植物BcMF4同源基因序列的比较分析

7.1.4 不同物种PGIP的分子相关性分析

7.2 结果与分析

7.2.1 BcMF4同源基因的克隆和测序

7.2.2 BcMF4同源基因序列特征的比较分析

7.2.3 BcMF4同源基因的序列比对和分析

7.2.4 不同物种PGIP的分子相关性分析

7.2.4.1 不同物种PGIP保守的Leu残基

7.2.4.2 保守的Cys残基分析

7.2.4.3 PGIP蛋白保守的结构功能域分析

7.2.4.4 PGIP分子进化树的构建

7.3 讨论

7.3.1 十字花科植物BcMF4同源基因的序列特征分析

7.3.2 不同物种中PGIP保守性分析

7.3.3 PGIP的系统进化及其在物种进化研究中的可行性分析

结论

参考文献

博士期间发表的论文

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].拟南芥蛋白质的互作机制及桑树同源基因功能的研究[D]. 沈国新.浙江大学2005
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