猪链球菌2型的分离鉴定以及实验性感染猪链球菌2型的病理学研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重要致病菌。根据其荚膜多糖（CPS）,将SS分为35个血清型,即1/2型和1～34型,其中猪链球菌2型是毒力最强、流行最广泛的血清型。2型猪链球菌可以引起猪发病,产生脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎和败血症等症状,其中以脑膜炎症状最为显著。我国于1998年、2005年分别在江苏省和四川省部分地区的猪群中暴发该病,并引起了人的感染和死亡。该病不仅给养猪业造成严重的经济损失,而且给公共卫生和食品安全造成严重威胁,已经成为全球性的人畜共患病,并引起很多国家的高度重视。我国对该病的研究热点主要集中在流行病学调查、病原性分析、疫苗和快速诊断技术研究,对猪链球菌2型的病理学缺乏系统研究。本文从华东某地区某猪场发生猪链球菌病样品中分离出一株猪链球菌,并进行了病原学研究,同时还运用猪链球菌2型四川分离株SSsc0501对仔猪进行实验性感染,开展系统的病理学研究。（一）猪链球菌2型的分离、鉴定及其荚膜多糖2J基因的克隆与序列分析2006年,华东地区某猪场饲养的猪急性发病,我们从病死猪的病料中成功分离到一株猪链球菌,经革兰氏染色、血清凝集试验和PCR鉴定,确诊为猪链球菌2型。通过对毒力因子的鉴定,结果发现MRP和EF均为阳性。将猪链球菌2型分离株用针对其CPS2J序列的特异性引物进行扩增,得到与预期大小相符的DNA片段,将PCR产物回收、连接、转化后测序,得到了676bp的核酸序列,同源性分析表明,SS2-HD01株CPS2J序列与已公布的国内外猪链球菌2型菌株核苷酸同源性在92.8%～99.9%之间,具有较高的同源性;与猪链球菌1型的同源性只有46.3%。（二）实验性感染猪链球菌2型的病理学研究选用40日龄体征健康的断奶仔猪10头,用2005年猪链球菌2型四川分离株SSsc0501通过肌肉注射进行人工感染,研究猪链球菌2型引起的仔猪各组织器官的病理学特征。结果表明,仔猪在人工感染22小时后出现临床症状,此后48小时内全部死亡,说明该2型猪链球菌对体征健康的仔猪致病性很强。该2型链球菌主要引起仔猪多器官出血性败血症。肝脏出血,肝索排列不齐,窦状隙内充满红细胞,中央静脉内有炎性细胞渗出,且中央静脉发生淤血。肝细胞发生肿胀,可见颗粒变性、水泡变性和脂肪变性;心脏无明显病变;脾脏出血,尤其是中央动脉周围出血严重,淋巴细胞减少,部分淋巴细胞坏死;肺脏可见间质性肺炎,肺泡的间隔增宽,出血,有大量炎性渗出,部分间质出现坏死灶,其中还发现有细菌,部分间质部血管出现透明血栓,支气管内有浆液性渗出物。肾脏髓质部间质出血,肾小球出血,部分肾小球出现萎缩,肾小囊增宽,出血。肾小管上皮细胞肿胀,细胞壁增厚,局部肾小管上皮细胞开始脱落;淋巴结出血,局部淋巴细胞发生坏死;大脑脑膜血管淤血,有大量炎性细胞,部分血管形成透明血栓,大脑出现噬神经元现象。肠道以出血症状为主,部分肠道出现炎性细胞渗出。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一篇 文献综述
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 2.1 感染动物
• 2.1.1 猪
• 2.1.2 其它动物
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 人
• 2.2 传播途径
• 2.3 流行季节与特点
• 2.4 诱发因素
• 2.5 国内流行情况
• 3 发病机理
• 3.1 黏附机制
• 3.2 侵袭机制
• 4 临床症状
• 5 病理变化
• 6 诊断
• 6.1 病原分离
• 6.2 全自动微生物分析系统生化试验鉴定
• 6.3 分群和型的鉴定
• 6.4 分子生物学诊断技术
• 7 动物模型
• 7.1 小鼠模型
• 7.2 豚鼠模型
• 7.3 仔猪模型
• 7.3.1 呼吸道接种
• 7.3.2 口腔胃肠道接种
• 7.3.3 静脉接种
• 7.4 其它动物模型
• 第二篇 实验部分
• （一） 猪链球菌2 型的分离、鉴定及其荚膜多糖2J 基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 实验仪器
• 1.1.3 pGEM-T Easy 载体
• 1.1.4 引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 细菌分离
• 1.2.2 玻片凝集实验
• 1.2.3 荚膜多糖基因的PCR 鉴定
• 1.2.3.1 模板DNA 的制备
• 1.2.3.2 PCR 鉴定
• 1.2.4 毒力因子MRP、EF 基因的鉴定
• 1.2.5 CPS2J 基因的PCR 及序列分析
• 1.2.5.1 PCR 扩增
• 1.2.5.2 PCR 产物胶回收与纯化
• 1.2.5.3 感受态大肠杆菌（DH5α）的制备
• 1.2.5.4 目的基因产物的连接与转化
• 1.2.5.4.1 目的基因与 pGEM-T easy 质粒载体的连接
• 1.2.5.4.2 质粒DNA 的转化与阳性重组质粒的筛选
• 1.2.5.5 SDS 碱裂解法制备质粒
• 1.2.5.6 质粒的酶切鉴定
• 1.2.5.7 序列测定
• 2 结果
• 2.1 组织触片
• 2.2 培养和染色特性
• 2.3 玻板凝集实验结果
• 2.4 荚膜多糖基因的PCR 鉴定结果
• 2.5 毒力因子MRP 基因的鉴定结果
• 2.6 毒力因子EF 基因的鉴定结果
• 2.7 CPS2J 基因的PCR 及序列分析结果
• 2.7.1 CPS2J 基因PCR 鉴定结果
• 2.7.2 质粒酶切鉴定结果
• 2.7.3 荚膜CPS2J 基因的测序结果
• 2.7.4 核苷酸序列分析
• 3 讨论
• （二） 实验性感染猪链球菌2 型的病理学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种及毒种
• 1.1.2 试剂及配方
• 1.1.3 实验动物
• 1.1.4 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌培养
• 1.2.1.1 液体培养
• 1.2.1.2 固体培养
• 1.2.1.3 活菌计数
• 1.2.2 动物分组及攻毒试验
• 1.2.2.1 实验动物分组
• 1.2.2.2 动物攻毒试验
• 1.2.3 临床观察
• 1.2.4 病理剖检
• 1.2.5 病理组织学检查
• 1.2.5.1 取样固定
• 1.2.5.2 组织脱水、透明、包埋、切片
• 1.2.5.3 HE 染色
• 1.2.5.4 显微镜观察
• 2 结果
• 2.1 临床观察
• 2.2 病理学检查
• 2.2.1 尸体剖检病变
• 2.2.2 病理组织学检查
• 2.2.2.1 肝脏
• 2.2.2.2 心脏
• 2.2.2.3 脾脏
• 2.2.2.4 肺脏
• 2.2.2.5 肾脏
• 2.2.2.6 淋巴结
• 2.2.2.7 骨骼肌
• 2.2.2.8 大脑
• 2.2.2.9 大肠和小肠
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢