论文摘要
目的糖尿病是一种以高血糖为特征的全身性代谢综合征,其所致各组织、器官的多种慢性并发症是影响糖尿病患者生活质量以及致死、致残的主要原因。长期以来,人们对糖尿病心脏、肾脏、神经以及视网膜等并发症进行了深入细致的研究。然而,有关糖尿病对肺脏的影响研究甚少。前期研究发现,糖尿病大鼠肺细胞外基质异常,肺间质可见促纤维化细胞因子——转化生长因子（TGF）-β1表达显著增加。糖尿病肺细胞外基质的改变是否与TGF-β1/Smad信号转导途径的过度激活有关尚不清楚。国内外有文献报道,应用胰高血糖素样肽（GLP）-1治疗可使自发性2型糖尿病大鼠模型（OLETF）大鼠肺毛细血管内皮细胞基底膜厚度明显降低,db/db小鼠肾脏TGF-β1、Ⅳ型胶原纤维表达显著减少。GLP-1是否可降低肺成纤维细胞TGF-β1分泌,进而下调TGF-β1/Smad信号转导途径,改善糖尿病肺细胞外基质的改变尚未见报道。本研究旨在探讨TGF-β1/Smad信号转导途径在糖尿病肺细胞外基质改变中的作用及GLP-1是否可通过影响肺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导途径,改善肺细胞外基质,初步探索GLP-1在改善糖尿病肺功能异常中的作用。为人们深入了解糖尿病肺功能异常的发病机制提供基础理论依据。方法1.4周龄OLETF大鼠12只和其同系非糖尿病对照组LETO大鼠8只,在无特定病原体级条件下单笼饲养,饲以标准饲料。大鼠定期行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。至30周龄,共有成模OLETF大鼠8只。继续饲养至42周龄,经股动脉放血处死大鼠,留取肺组织。①HE、Masson染色观察各组大鼠肺组织结构和胶原纤维沉积情况；②western blotting检测各组大鼠肺组织Smad3、Smad7、Ⅲ型胶原纤维的表达；③ELISA检测各组大鼠肺组织TGF-β1的表达。2.培养人胚肺成纤维细胞系（MRC-5）。首先,①RT-PCR检测MRC-5细胞GLP-1受体（GLP-1R）mRNA表达；②提取MRC-5细胞膜蛋白,western blotting检测GLP-1R蛋白表达,印证MRC-5细胞是GLP-1作用的靶细胞。然后,在不同葡萄糖浓度下培养MRC-5细胞,分别给予GLP-1（10nmol/L）干预24、48、72h后提取MRC-5细胞总mRNA和蛋白。①实时荧光定量PCR检测各组MRC-5细胞FN、Ⅲ型胶原mRNA表达；②western blotting检测各组MRC-5细胞TGF-β1、p-Smad3（p-Smad3）、Smad7、纤维连接蛋白（FN）、Ⅲ型胶原蛋白表达；③ELISA检测各组MRC-5细胞培养液中TGF-β1表达。结果1. OLETF大鼠较LETO大鼠肥胖,活动迟缓、懒动、毛色干枯无光泽。成模及实验结束时同周龄LETO大鼠体重、OGTT 0-120min血糖曲线下面积、OGTT同步胰岛素曲线下面积均低于OLETF大鼠（P<0.05）。①HE染色显示LETO大鼠肺泡结构正常,OLETF大鼠肺组织结构紊乱,支气管壁、肺泡壁增厚,肺泡上皮细胞显示不清,肺泡萎缩、塌陷,肺间质和血管周围细胞外基质增多,成纤维细胞增多,并有炎症细胞浸润。②Masson染色显示LETO大鼠肺间质、血管周围有少量胶原纤维。OLETF大鼠肺间质胶原纤维增多,排列紊乱,毛细血管周围胶原纤维增多。③OLETF大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、Ⅲ型胶原蛋白表达显著高于LETO大鼠,Smad7蛋白表达显著低于LETO大鼠（均P<0.05）。OLETF大鼠肺组织TGF-β1与Smad3呈显著正相关（γ=0.853,P<0.05）,与Smad7呈负相关（γ=-0.720,P<0.05）。2.在MRC-5细胞中检测到GLP-1R mRNA表达,在其膜蛋白中检测到GLP-1R蛋白表达。高糖状态下MRC-5细胞TGF-β1、p-Smad3蛋白以及FN、Ⅲ型胶原纤维mRNA和蛋白表达均显著增高,Smad7蛋白表达显著降低,细胞培养液中的TGF-β1表达亦显著增高（均P<0.05）；给予GLP-1干预后,上述各检测指标均得以逆转,差异有统计学意义（均P<0.05）结论①高血糖可能过度激活了OLETF大鼠肺组织TGF-β1/Smad信号转导途径,导致胶原纤维生成增加,细胞外基质代谢紊乱。②GLP-1可能通过下调TGF-β1/Smad信号转导途径,降低高血糖状态下人胚肺成纤维细胞FN及Ⅲ型胶原纤维表达。