论文摘要
戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的急性自限性疾病。其临床特征为发热、全身疲乏、食欲不振、厌油腻、恶心、呕吐、尿色深黄如浓茶、眼睛和皮肤发黄,肝功能检查出现转氨酶迅速升高到几百甚至几千单位,黄疸较常见,并可持续1周。在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍,在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50%,是导致发病和病死的重要因素,尤其对孕妇可造成有20%的病死率。由于在灵长类、啮齿类以及各种家禽家畜体内也检测到HEV抗体,提示其可能为一种人畜共患病。HEV过去曾被认为是一种经肠道传播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫电镜技术从一名志愿受试者粪便中观察到直径为2730nm的病毒样颗粒,从而证实该病毒为新型的非甲非乙型肝炎病毒,1989年东京国际会议正式将这一类型的肝炎及其相关病毒分别命名为戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因组为单股正链RNA,约7.5kb,具有3个开放读码框（ORF）。病毒基因组的5′端到3′端依次为5′端非编码区（5′-NCR）、ORF1、ORF3、ORF2、3′-NCR及polyA尾。HEV全球分布,危害严重。虽然HEV诊断方法不断得到改进,但是安全有效疫苗的研制是控制HEV感染、预防HE发生的根本措施。明确HEV抗原表位是开发HEV诊断试剂和研制疫苗的基础。国内外曾就重组蛋白和合成肽对HEV ORF2编码结构蛋白的免疫原性做了大量研究,发现在其羧基端集中了具有较强免疫反应性的主要抗原表位。ORF2编码的衣壳蛋白的上抗原表位数量多,结构复杂,其富含疏水区的C端2/3部分存在多个免疫优势B细胞表位,包括能诱导中和抗体的抗原结合位点。因此本研究使用的免疫原是原核表达的含有swDQ株HEV ORF2 C端220个氨基酸残基的V1蛋白,制备了6株针对V1蛋白的单抗,而通过单克隆抗体技术对HEV抗原表位进行深入研究,不仅有助于了解HEV抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意义。本研究首先构建了含swDQ株HEV V1蛋白的原核表达载体pET32a-V1,并在大肠杆菌中进行了表达,利用HEV感染猪血清对表达产物进行Western blot分析,证实表达的融合蛋白都具有较好的反应活性。然后以表达的融合蛋白为抗原,免疫BAL B/c小鼠,最终共获得了6株针对V1蛋白的单抗。利用肽扫描技术对6株V1蛋白的单克隆抗体（αC11、αC12、γH1、γF8、BC4、CH8）的抗原表位进行了研究。将V1蛋白基因分为两个相互重叠的基因片段M1和M2,对6株抗V1蛋白的单抗进行鉴定,结果显示有3株单抗既能特异性识别M1又能识别M2的表达产物,说明这三株单抗所针对的表位位于M1和M2的重叠区,即位于ORF2 492500aa （HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的492500aa）;其余3株单抗中有两株单抗仅能识别M1的表达产物,另外一株单抗仅能识别M2的表达产物。将片段M1（386-492aa）和M2（500-606aa）人工合成一套彼此重叠8个氨基酸长度为16个氨基酸的25个短肽,融合表达后与MAbs进行Western blot和ELISA反应性扫描,对3株单抗鉴定结果显示,一株单抗与融合多肽E4和E5反应而不与其他短肽反应,说明这株单抗所针对的表位位于E4与E5的重叠区ORF2 418425aa（HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的418425aa）;有一株单抗能特异性识别融合多肽E1而不识别融合多肽E2,说明这株单抗所针对的表位位于E1与E2的不重叠区ORF2 386394aa（HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的386394aa）;另外一株单抗与融合多肽E24和E25反应而不与其他短肽反应,说明这株单抗所针对的表位位于E24与E25的重叠区ORF2 588595aa（HEV ORF2编码的病毒结构蛋白的588595aa）。其中,表位418425aa和表位492500aa为首次发现。应用纯化的表位融合蛋白对小鼠进行免疫,结果表明4个融合蛋白均能诱导小鼠产生针对短肽的特异性抗体。将纯化的表位融合蛋白进行SDS-PAGE电泳,与抗swDQ株HEV猪血清进行Western blot分析,结果表明这四个表位融合蛋白具有较好的反应原性。本研究对swDQ株HEV V1蛋白进行抗原表位的鉴定,将有助于进一步阐明HEV的结构与功能,将为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位疫苗的设计研究提供重要的研究工作基础。