缺刻蛋白转基因水稻的培育

论文摘要

水稻锯齿叶矮缩病（Rice Ragged stunt Disease）是由水稻锯齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）感染引起的一种水稻病毒病。水稻锯齿叶矮缩病毒侵染水稻后,出现的一个明显的表型特征是引起水稻叶片的卷叶、缺刻。有研究表明,缺刻蛋白（SE）在植物叶片的生长发育调控上起着重要的作用。经过RT-PCR检测感病水稻中SE基因表达量的变化,发现SE1基因的表达量明显升高,而SE2和SE3基因的表达量没有明显变化。为了证明感病水稻的这种症状是由SE基因的过表达引起的,我们构建了SE的过表达植物表达载体和RNA干扰（RNA interference,RNAi）植物表达载体。利用农杆菌介导的水稻遗传转化方法转化日本晴水稻。对获得的转基因水稻进行PCR检测结果表明在获得的转基因水稻中大部分呈现抗性。选择抗性的转基因水稻进行RT-PCR检测其SE基因的表达量发现所选的所有呈现阳性植株中SE基因的表达量都明显升高。说明抗性的植株中SE基因过表达。同样对抗性植株进行western bolt检测,结果发现在所选的植株中,SE的表达量明显升高。证明获得的SE过表达植株中SE确实过表达了。进一步证明所获得转基因植株为抗性植株。经过对转基因水稻的抗性植株表型分析发现,转SE1基因的过表达载体在水稻幼苗期和成苗期都出现了卷叶的症状。并且容易致死。而其他转基因植株表型没有明显变化。这和之前对RRSV侵染后的水稻中SE基因表达量的检测结果一致。说明,SE1的过表达确实会引起水稻的卷叶。另外,在SE1的过表达植株中,发现在生根期和炼苗期的水稻幼苗生长缓慢。而成年水稻的生长发育和对照组没有明显差别。说明SE表达量的变化对水稻生长发育的影响主要表现在幼苗期。分析可能的原因是由于SE参与miRNA前体的加工过程,而SE的过表达导致成熟miRNA的积累,通过miRNA调节作用,使和植物生长发育相关基因的成熟mRNA减少,导致水稻的生长缓慢。而在水稻生长的后期,和植物生长发育相关基因的成熟mRNA量得到足够的积累,因此,水稻的生长又恢复正常。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 水稻锯齿叶矮缩病毒
• 1.1.1 水稻锯齿叶矮缩病毒的研究概况
• 1.1.2 水稻锯齿叶矮缩病毒的发生及其危害
• 1.1.3 水稻锯齿叶矮缩病毒的传播方式
• 1.1.4 水稻锯齿叶矮缩病的发病特征
• 1.1.5 水稻锯齿叶矮缩病的诊断方法
• 1.1.6 水稻锯齿叶矮缩病的防治措施
• 1.2 缺刻蛋白研究进展
• 1.2.1 缺刻蛋白研究进展
• 1.2.2 缺刻蛋白的功能
• 1.2.2.1 缺刻蛋白对植物叶片生长的影响
• 1.2.2.2 缺刻蛋白参与microRNA前体的加工
• 1.2.3 缺刻蛋白对叶片发育的调控机制
• 1.3 microRNA的研究进展
• 1.3.1 microRNA的研究概况
• 1.3.2 microRNA的功能
• 1.3.3 与叶片发育有关的microRNA
• 1.3.4 miRNA与植物的生长发育
• 1.4 水稻遗传转化研究进展
• 1.4.1 水稻遗传转化发展历程
• 1.4.2 一种快速水稻遗传转化方法的建立
• 1.4.3 水稻遗传转化的方法
• 1.4.4 影响遗传转化的因素
• 1.4.5 我国水稻遗传转化的研究进展
• 1.4.6 水稻遗传转化面临的挑战
• 1.5 研究的目的及意义
• 第二章 RRSV侵染水稻后缺刻蛋白基因表达量验证
• 2.1 材料与主要试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.3 病株的分子检测
• 2.3.1 植物总RNA的提取
• 2.3.2 RNA的反转录
• 2.3.3 cDNA的PCR扩增
• 2.3.4 结果分析
• 2.4 Real-time PCR检测
• 2.4.1 Real-time PCR检测引物的设计
• 2.4.2 利用试剂盒提取感病水稻叶片总RNA
• 2.4.3 Real-time PCR检测感病水稻缺刻蛋白表达量
• 2.4.4 结果分析
• 第三章 水稻缺刻基因的克隆与植物表达载体的构建
• 3.1 材料与主要试剂
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 水稻缺刻基因的克隆
• 3.2.1 水稻缺刻基因的引物设计
• 3.2.2 水稻总RNA的提取与反转录
• 3.2.3 目的DNA片段的扩增
• 3.2.4 目的片段的回收
• 3.2.5 目的DNA片段连接pEASY-T5 Zero Blunt克隆载体
• 3.2.6 感受态细胞的制备和连接反应对宿主感受态细胞的转化
• 3.2.6.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 3.2.6.2 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞
• 3.2.7 小量质粒的提取
• 3.2.8 阳性重组子的PCR和酶切鉴定
• 3.2.9 结果分析
• 3.3 植物表达载体的构建
• 3.3.1 实验方法
• 3.3.2 结果分析
• 3.4 RNAi载体的构建
• 3.4.1 引物的设计
• 3.4.2 构建RNAi植物表达载体
• 3.4.2.1 目的片段的获取及其克隆
• 3.4.2.2 中间载体PUCC构建
• 3.4.2.3 植物表达载体PXQ-Act的构建
• 3.4.3 结果分析
• 3.5 植物表达载体转化农杆菌EHA105菌株
• 3.5.1 农杆菌EHA105感受态细胞的制备
• 3.5.2 重组质粒转化农杆菌感受态细胞
• 3.5.3 重组子转化农杆菌后的菌液PCR鉴定
• 3.5.4 结果分析
• 第四章 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 4.1 材料与主要试剂
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 水稻成熟胚愈伤的诱导
• 4.2.2 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 4.2.3 水稻植株的再生
• 4.2.4 结果分析
• 4.3 转基因水稻的分子检测
• 4.3.1 转基因水稻的分子检测
• 4.3.1.1 CTAB法提取水稻叶片DNA
• 4.3.1.2 转基因水稻的PCR检测
• 4.3.2 RT-PCR检测转基因水稻缺刻蛋白基因的表达量
• 4.3.3 Western blot检测转基因水稻中缺刻蛋白表达量
• 4.3.3.1 转基因水稻蛋白的提取
• 4.3.3.2 Western blot检测蛋白表达量
• 4.3.4 结果分析
• 4.4 转基因水稻的表型症状及其分析
• 第五章 全文总结与讨论
• 参考文献
• 附录一 常用培养基的配制
• 附录二 转基因培养基的配制
• 附录三 western bolt试剂的配制
• 附录四 载体图谱
• 致谢