植物和微生物凝集素的提取纯化及特性比较分析

论文摘要

采用Sepharose CL-6B亲和层析提取分离三种植物种子（白果、苦瓜籽、蓖麻子）和大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）中的半乳糖结合凝集素。凝血实验以及还原性和非还原性SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测所提取蛋白的凝血特性和分子构成；并对所提取的4种不同蛋白进行比较,分析其在进化上的关系。实验结果显示,目标蛋白经过简单的步骤即可得到纯化。提取所得的4种不同的目的蛋白均具有凝血效果,且半乳糖均可以抑制这4种蛋白的凝集作用,而葡萄糖对其却没有抑制效果,证明实验所提取的目的蛋白为半乳糖结合凝集素。还原性和非还原性SDS-PAGE实验结果显示,白果凝集素（SGA）是单亚基蛋白,分子量约为32kDa；蓖麻凝集素（RCA1）和苦瓜凝集素（MCL）均为4亚基蛋白,分子量分别约为120kDa和116kDa。而E. coli半乳糖结合凝集素（EGA）也是单亚基蛋白,但其分子量约为45kDa。对研究结果的进一步分析表明,SGA只有一条结合半乳糖的B链亚基（糖结合位点识别链,约32kDa）,而RCA1和MCL则是在B链亚基的基础上演化而成的四聚体蛋白。未发现EGA与其他三种植物半乳糖结合凝集素的同源关系。研究证明,Sepharose CL-6B亲和层析在提取分离半乳糖结合凝集素,尤其是含有B链亚基的凝集素的应用上有巨大的优势和潜力。本研究不仅为植物和微生物中的半乳糖结合凝集素的纯化提供了理想的方法,而且对认识半乳糖结合凝集素在进化史上的演化提供了初步的理论支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 凝集素概况
• 1.1.1 植物凝集素
• 1.1.1.1 植物凝集素的定义及分类
• 1.1.1.2 植物凝集素的结构及作用方式
• 1.1.1.3 植物凝集素的功能及研究意义
• 1.1.2 微生物凝集素
• 1.1.2.1 微生物凝集素的发现及分类
• 1.1.2.2 微生物凝集素的功能及研究意义
• 1.1.3 半乳凝素
• 1.1.3.1 半乳凝素凝集素的成员及结构
• 1.1.3.2 半乳凝素的生物学功能
• 1.1.3.3 植物及微生物中的半乳糖结合蛋白
• 1.2 蓖麻子、苦瓜籽、白果及大肠杆菌半乳糖结合凝集素概况
• 1.2.1 蓖麻凝集素
• 1.2.2 苦瓜凝集素
• 1.2.3 白果半乳糖结合凝集素
• 1.2.4 大肠杆菌半乳糖结合凝集素
• 1.3 凝集素纯化技术
• 1.3.1 凝集素纯化技术概况
• 1.3.2 Sepharose CL-6B亲和层析纯化凝集素
• 1.3.2.1 亲和层析
• 1.3.2.2 Sepharose CL-6B填料
• 1.3.2.3 Sepharose CL-6B亲和层析用于分离半乳糖结合凝集素
• 1.4 本研究的内容、目的和意义
• 第2章 方法
• 2.1 采用SEPHAROSE CL-6B亲和层析从白果、苦瓜子、蓖麻子和大肠杆菌中分离半乳糖结合蛋白
• 2.1.1 蓖麻凝集素的提取纯化
• 2.1.1.1 蛋白粗提液的制备
• 2.1.1.2 Sepharose CL-6B亲和层析
• 2.1.2 苦瓜凝集素的提取纯化
• 2.1.2.1 蛋白粗提液的制备
• 2.1.2.2 Sepharose CL-6B亲和层析
• 2.1.3 白果半乳糖结合蛋白的提取纯化
• 2.1.3.1 蛋白粗提液的制备
• 2.1.3.2 Sepharose CL-6B亲和层析
• 2.1.4 大肠杆菌半乳糖结合蛋白的提取纯化
• 2.1.4.1 蛋白粗提液的制备
• 2.1.4.2 Sepharose CL-6B亲和层析
• 2.1.4.3 葡聚糖G-75（Sephadex G-75）分子筛纯化目标蛋白
• 2.2 目的蛋白的凝血实验
• 2.3 目的蛋白的还原性和非还原性SDS-PAGE检测
• 第3章 结果
• 3.1 分离纯化结果
• 3.2 凝血实验结果
• 3.3 电泳结果
• 3.3.1 蓖麻子半乳糖结合蛋白的SDS-PAGE结果
• 3.3.2 苦瓜籽半乳糖结合蛋白的SDS-PAGE结果
• 3.3.3 白果半乳糖结合蛋白的SDS-PAGE结果
• 3.3.4 E.coli半乳糖结合蛋白的SDS-PAGE结果
• 3.3.5 4种半乳糖结合蛋白的SDS-PAGE结果比较
• 第4章 讨论
• 4.1 SEPHROSE CL-6B亲和层析半乳糖结合凝集素
• 4.2 凝血实验
• 4.3 目标蛋白亚基结构比较
• 4.3.1 蓖麻凝集素、苦瓜凝集素及白果凝集素亚基结构比较
• 4.3.2 大肠杆菌半乳糖结合凝集素
• 第5章 结论展望
• 参考文献
• 附录1 实验材料与试剂
• 附录2 缓冲液配置
• 附录3 聚丙烯酰胺—十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢