论文摘要
目的:血管性痴呆（vascular dementia, VD）由于各种脑血管病引起的获得性认知功能障碍,以学习、记忆功能缺损为主要症状,可伴有语言、运动、视空间及人格障碍等。随着社会人口的日益老龄化和脑卒中治愈率的不断提高,VD的发病呈迅速增长趋势,成为神经内科的常见病、多发病,给社会和家庭带来沉重的负担。目前VD的发病机制尚未明确,也无特效的防治方法,因此探讨和阐明VD的发病机理,对于临床制定更加合理的治疗方案具有重要的价值和理论意义。学习和记忆是大脑的高级功能之一。学习是指经验及技能的获得,记忆是经验及技能的保存及再现,它们是两个不同而又密切联系的神经生物过程。目前认为,海马与学习、记忆等高级认知功能密切相关,其神经元形态正常与否对学习、记忆的形成和维持具有重要意义。现代大量资料研究证实海马与长时程增强（long-term potentiation,LTP）和学习、记忆过程密切相关,人们称LTP可能是“记忆的突触模型”、“记忆的神经元机制”。LTP形成后,动物的学习能力增强;而通过受体阻断剂阻抑LTP的产生,则影响动物的学习能力,记忆亦受损。而谷氨酸及其受体参与了LTP的产生与维持。谷氨酸（Glutamate,Glu）是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神经递质,主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体,在学习、记忆、突触可塑性及大脑发育等方面均起重要作用。研究证实,Glu的神经递质作用是通过兴奋性氨基酸受体而实现的,受体活性的变化、受体数目的增减都会对突触效能产生明显的影响。在对LTP的研究中,人们发现谷氨酸受体对LTP的诱导具有重要意义,这些受体的特异性拮抗剂不但可阻断LTP的诱导,而且可破坏多种学习和记忆行为。神经细胞内钙离子浓度（intracellular concentration of calcium,[Ca2+]i）、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ, CaMPKⅡ）及钙调素（CaM）一直是脑组织缺血缺氧损伤机制研究的焦点。多种脑缺血动物模型的研究表明,神经细胞内钙超载（Ca2+ over-loading）及CaMPKⅡ水平升高参与了脑组织缺血损伤;并且应用Ca2+通道拮抗剂抑制钙超载,可以减轻神经细胞缺血性损伤。有些学者对缺血性脑组织损伤做了进一步研究,发现缺血后神经细胞内环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP- responsive element binding protein, CREB）水平升高,神经突触后膜谷氨酸受体表达增多,二者均参与了脑组织缺血性损伤。目前认为,在生理状态下神经细胞[Ca2+]i是参与学习和记忆机制的细胞内第二信使;CREB作为核内的“第三信使”,具有调节包括学习记忆在内的广泛生物学的功能,是细胞内多种信号通路的一种关键成分,而神经细胞膜Glu受体N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole propionic acid, AMPA）受体及细胞内[Ca2+]i、CaM、CaMPKⅡ、CREB水平的变化对学习和记忆的影响,也逐渐成为了多数学者研究的热点。也有学者对老年性痴呆（Alzheimers dementia, AD）动物模型进行了研究,发现AD模型脑组织内钙离子超载、谷氨酸受体水平降低。这些研究结果为我们探讨VD动物模型脑组织内谷氨酸受体、钙信号转导机制及CREB改变提供了线索。丁苯酞（dl-3n-butylphthalide,NBP）系从天然食用植物芹菜籽中提取并经消旋合成的黄色油状液体,具有芹菜香味。该药为国家一类新药,国外对该药的研究尚未见报道,国内冯亦璞等对丁苯酞治疗脑缺血的相关机制做了大量的实验研究,发现丁苯酞具有多靶点抗脑缺血作用,能改善线粒体功能,提高脑血管内皮NO和PGI2的水平,抑制谷氨酸释放,降低细胞内钙浓度和花生四烯酸含量,抑制自由基和提高抗氧化酶活性,减轻脑缺血所致脑水肿,抗血栓形成和抗血小板聚集,缩小脑梗死面积,改善局部脑血流量和细胞能量代谢、神经功能缺失及脑缺血记忆障碍。但该药对VD的实验研究尚未见相关报道。基于此,本文通过探讨谷氨酸受体及钙信号转导机制,观察丁苯酞治疗VD的效果并探讨其作用机制。方法:1采用三次双侧颈总动脉结扎,造成脑组织反复缺血/再灌注,建立了小鼠VD模型,建立假手术组排除手术本身对小鼠所致的影响,通过跳台试验和水迷宫试验进行学习和记忆成绩测试,观察其行为学改变;用HE染色观察海马病理学特征变化。2采用免疫组化和反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定各组小鼠海马谷氨酸AMPA-GluR2蛋白及GluR2 mRNA的变化。3采用免疫组化和RT-PCR方法测定各组小鼠海马谷氨酸NMDA-NR2B蛋白及NR2B mRNA的变化。4采用流式细胞分析技术测定各组小鼠海马细胞[Ca2+]i变化;Western-Blot及RT-PCR方法检测CaMPKII蛋白及mRNA表达的变化。5 Western-Blot及RT-PCR方法检测CREB蛋白及mRNA表达的变化。结果:1 VD小鼠模型的行为学评价及海马病理学特征3月龄雄性昆明小鼠196只,分为假手术对照组、VD模型组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组。采用双侧颈总动脉结扎,连续三次脑缺血（20 min）再灌注（10min）,建立VD小鼠模型。术后29d,各组分别进行跳台试验及水迷宫实验,测试学习成绩;术后30d测试记忆成绩,HE染色观察各组小鼠海马组织病理学特征。1.1学习成绩术后第29天,分别进行跳台试验和水迷宫试验,测试跳台试验反应时间（sec）和错误次数（number/5 min）作为学习成绩,水迷宫试验游完全程时间（sec）和错误次数（number/3 min）作为学习成绩。跳台试验结果显示:⑴与假手术对照组的反应时间（48.76±9.24）s比较,VD模型组小鼠学习阶段的反应时间（89.41±12.08）s明显延长（P<0.01）;⑵与VD模型组的反应时间比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的反应时间（59.68±10.27）s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的的反应时间（57.23±10.05）s均明显缩短（P<0.01）;⑶与假手术对照组的错误次数（1.23±0.27）比较,VD模型组小鼠学习阶段的错误次数（3.74±0.42）明显增加（P<0.01）;⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数（1.52±0.38）及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的的错误次数（1.48±0.31）均明显减少（P<0.01）;⑸假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组之间的学习成绩无显著性差异（P>0.05）。水迷宫试验结果显示:⑴与假手术对照组的游全程时间（87.32±13.46）s比较,VD模型组小鼠学习阶段的游全程时间（145.80±13.29）s明显延长（P<0.01）;⑵与VD模型组的游全程时间比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的游全程时间（101.89±18.38）s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的游全程时间（99.18±11.25）s明显缩短（P<0.01）;⑶与假手术对照组的错误次数（16.88±4.19）比较,模型组小鼠学习阶段的错误次数（34.60±5.92）明显增多（P<0.01）;⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数（18.71±4.35）及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的错误次数（17.29±4.82）明显减少（P<0.01）;⑸假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组的学习成绩之间无显著性差异（P>0.05）。以上结果提示VD模型小鼠的学习成绩降低,丁苯酞可以改善其学习成绩。1.2记忆成绩术后第30天,分别进行跳台试验和水迷宫试验,测试跳台试验潜伏时间（sec）和错误次数（number/5min）作为记忆成绩,水迷宫试验游完全程时间（sec）和错误次数（number / 3 min）作为记忆成绩。跳台试验结果显示:⑴与假手术对照组的潜伏时间（148.92±20.83）s比较,VD模型组小鼠记忆阶段的潜伏时间（78.67±19.17）s明显缩短（P<0.01）;⑵与VD模型组的潜伏时间比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的潜伏时间（131.41±18.82）s及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的潜伏时间（128.57±18.29）s均明显延长（P<0.01）;⑶与假手术对照组的错误次数（0.32±0.05）比较,VD模型组小鼠记忆阶段的错误次数（1.72±0.13）明显增加（P<0.01）;⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数（0.54±0.08）及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的错误次数（0.50±0.07）均明显减少（P<0.01）;⑸假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组之间的记忆成绩无显著性差异（P>0.05）。结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低,丁苯酞可以改善其记忆成绩。水迷宫试验结果显示:⑴与假手术对照组的游全程时间（67.82±8.79）比较,VD模型组小鼠记忆阶段的游全程时间（137.40±11.86）明显延长（P<0.01）;⑵与VD模型组的游全程时间比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间（88.73±9.53）及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间（83.87±8.62）明显缩短（P<0.01）;⑶与假手术对照组的错误次数（9.57±2.91）比较,模型组小鼠记忆阶段的错误次数（20.90±4.25）明显增多（P<0.01）;⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数（11.17±3.04）及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的错误次数（10.27±2.83）明显减少（P<0.01）;⑸假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组的记忆成绩之间无显著性差异（P>0.05）。以上结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低,丁苯酞可以改善其记忆成绩。1.3 VD小鼠海马病理学改变在光镜下,⑴假手术对照组小鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列较致密整齐。⑵相比之下,VD模型组小鼠海马CA1区锥体细胞松散,层次不清,有细胞缺失现象;炎性细胞浸润;部分细胞旁有空染区,核固缩、胞质浓染、胞体变小,并且有胶质细胞增生形成结节。⑶丁苯酞治疗组和预防治疗组小鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,未发现炎性细胞浸润,核固缩现象较少见。2 VD小鼠海马CA1区AMPA-GluR2受体表达水平及丁苯酞的影响2.1 AMPA-GluR2免疫组化染色小鼠10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行免疫组化染色,观察GluR2阳性神经元数目的变化。结果显示:⑴与假手术对照组海马CA1区AMPA-GluR2阳性神经元面密度（124.37±7.48）比较,VD模型组小鼠海马CA1区GluR2阳性神经元面密度值（27.69±5.15）明显减少（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区GluR2阳性神经元面密度值（88.57±10.98）和丁苯酞预防组小鼠海马CA1区GluR2阳性神经元面密度值（94.42±12.37）明显增多（P<0.05）;⑶丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组海马CA1区GluR2阳性神经元面密度值之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马CA1区GluR2水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞和丁苯酞预防治疗组可以防止VD小鼠海马CA1区GluR2水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。2.2 AMPA-GluR2 mRNA RT-PCR检测冰上迅速分离小鼠海马,Trizol （Invitrogen公司）提取海马总RNA,测定其浓度及纯度。每个样品取2μg RNA反转录合成cDNA,再各取1μL cDNA进行PCR扩增。取RT-PCR产物5μL在2 %琼脂糖凝胶上电泳,用UVP凝胶成像系统扫描定量电泳条带的灰度,以GluR2 /β-actin表示产物的相对含量,凝胶图像分析系统分析结果。结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马CA1区GluR2 mRNA表达的灰度值（0.96±0.21）比较,VD模型组小鼠海马CA1区GluR2 mRNA表达的灰度值（0.28±0.07）显著降低（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区GluR2 mRNA表达的灰度值（0.71±0.15）和丁苯酞预防治疗组小鼠海马CA1区GluR2 mRNA表达的灰度值（0.75±0.18）显著升高（P<0.05）;⑶丁苯酞组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组海马CA1区GluR2 mRNA表达的灰度值之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马CA1区GluR2水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止VD小鼠海马CA1区GluR2 mRNA水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。3 VD小鼠海马CA1区NMDA-NR2B受体表达水平及丁苯酞的影响免疫组化观察NMDA-NR2B受体的变化,RT-PCR观察NMDA-NR2B mRNA表达的变化。方法同2。3.1 NMDA-NR2B受体免疫组化染色结果显示:⑴与假手术对照组海马CA1区NMDA-NR2B阳性神经元面密度值为:（149.27±8.67）比较,VD模型组小鼠海马CA1区NR2B阳性神经元面密度值（29.70±2.09）明显减少（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞预防治疗组小鼠海马CA1区NMDA-NR2B阳性神经元面密度值（108.51±7.28）和丁苯酞组小鼠海马CA1区NMDA-NR2B阳性神经元面密度值（100.53±10.00）明显增多（P<0.05）;⑶丁苯酞组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组海马CA1区NMDA-NR2B阳性神经元面密度值之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马CA1区NMDA受体水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止VD小鼠海马CA1区NMDA受体水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。3.2 NMDA受体mRNA RT-PCR检测结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马CA1区NMDA受体mRNA表达的灰度值（0.71±0.18）比较,VD模型组小鼠海马CA1区NMDA受体mRNA表达的灰度值（0.22±0.04）显著降低（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区NMDA受体mRNA表达的灰度值（0.54±0.11）和丁苯酞预防组小鼠海马CA1区NMDA受体mRNA表达的灰度值（0.59±0.20）显著升高（P<0.05）;⑶丁苯酞组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组海马CA1区NMDA受体mRNA阳性神经元密度之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马CA1区NMDA受体水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止VD小鼠海马CA1区NMDA受体mRNA水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。4 VD小鼠海马神经元钙信号转导机制及丁苯酞的影响4.1 VD小鼠海马神经元静息态[Ca2+]i的变化及丁苯酞的影响小鼠经10%水合氯醛麻醉后处死,采用机械法在低温修块台上快速分离双侧海马组织,并制备海马细胞悬液,负载Fluo-3/AM,采用流式细胞分析技术观察了VD海马细胞静息态[Ca2+]i变化特征及丁苯酞干预效果。结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i浓度（1.29±0.32）比较,VD模型组小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i浓度（1.92±0.35）显著升高（P<0.01）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i浓度（1.34±0.28）和丁苯酞预防组小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i浓度（1.33±0.41）显著降低（P<0.05）;⑶丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i浓度之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马细胞钙超载参与了其发病机制,丁苯酞可以抑制VD小鼠海马细胞钙超载而改善其学习和记忆成绩。4.2 VD小鼠海马神经元CaMPKⅡ表达水平的变化特征及丁苯酞的影响小鼠断头处死,快速分离海马组织,提取总蛋白。考马斯亮蓝法进行蛋白浓度定量。应用Western-Blot方法对VD小鼠海马组织CaMPKⅡ的蛋白水平进行了检测。结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马组织CaMPKⅡ蛋白表达水平（1.06±0.14）比较,VD模型组小鼠海马组织CaMPKⅡ蛋白表达水平（0.30±0.07）显著降低（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞预防治疗组小鼠海马组织CaMPKⅡ蛋白表达水平（0.98±0.27）和丁苯酞治疗组小鼠海马组织CaMPKⅡ蛋白表达水平（0.94±0.13）显著升高（P<0.01）;⑶假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组小鼠海马组织CaMPKⅡ蛋白表达水平之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马组织CaMPKⅡ蛋白表达水平的降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止并改善VD小鼠海马神经元CaMPKⅡ蛋白表达水平下降而促进其学习和记忆成绩改善。4.3 VD小鼠海马神经元CaMPKⅡmRNA RT-PCR结果标本取材同2。结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马CA1区CaMPKⅡmRNA表达的灰度值（0.92±0.15）比较,VD模型组小鼠海马CA1区CaMPKⅡmRNA表达的灰度值（0.31±0.06）显著降低（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区CaMPKⅡmRNA表达的灰度值（0.78±0.11）和丁苯酞预防组小鼠海马CA1区CaMPKⅡmRNA表达的灰度值（0.82±0.14）明显增多（P<0.05）;⑶假手术对照组、丁苯酞组、丁苯酞预防治疗组海马CA1区CaMPKⅡmRNA表达的灰度值之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马CA1区CaMPKⅡ水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止VD小鼠海马CA1区CaMPKⅡmRNA水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。5 VD小鼠海马神经元CREB水平变化及丁苯酞的影响5.1 VD小鼠海马神经元CREB表达水平的变化特征及丁苯酞的影响小鼠断头处死,快速分离海马组织,提取核蛋白。考马斯亮蓝法进行蛋白浓度定量。应用Western-Blot方法对VD小鼠海马组织CREB的蛋白表达水平进行了检测。结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马组织CREB蛋白表达水平（1.37±0.21）比较,VD模型组小鼠海马组织CREB蛋白表达水平（0.43±0.06）显著降低（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马组织CREB蛋白表达水平（1.06±0.12）和丁苯酞预防治疗组小鼠海马组织CREB蛋白表达水平（1.12±0.14）显著升高（P<0.01）;⑶丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组小鼠海马组织CREB蛋白表达水平之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马组织CREB蛋白表达水平的降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止并改善VD小鼠海马组织CREB蛋白表达水平下降而促进其学习和记忆成绩改善。5.2 VD小鼠海马神经元CREB mRNA RT-PCR结果取材方法同2。结果显示:⑴与假手术对照组小鼠海马CA1区CREBmRNA表达的灰度值（0.98±0.17）比较,VD模型组小鼠海马CA1区CREB mRNA表达的灰度值（0.29±0.04）显著降低（P<0.05）;⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区CREB mRNA表达的灰度值（0.82±0.09）和丁苯酞预防治疗组小鼠海马CA1区CREB mRNA表达的灰度值（0.84±0.11）明显增多（P<0.05）;⑶假手术对照组、丁苯酞组、丁苯酞预防治疗组海马CA1区CREB mRNA表达的灰度值之间无明显差异（P>0.05）。此可以提示VD小鼠海马CA1区CREB水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞可以防止VD小鼠海马CA1区CREB mRNA水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。结论:⑴本实验建立的VD小鼠模型可模拟人类VD以学习和记忆能力缺损为主的认知功能障碍,是研究VD比较理想的动物模型,对深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海马CA1区出现病理性变化。⑵VD小鼠海AMPA-GluR2蛋白和mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致,提示GluR2表达水平降低可能参与了VD的发病。⑶VD小鼠海马NMDA-NR2B蛋白和mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致,提示NMDA-NR2B表达水平降低可能参与了VD的发病。⑷VD小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i升高,CaMPKⅡ蛋白表达及CaMPKⅡmRNA水平降低,导致钙信号转导系统功能紊乱,可能参与了VD的分子生物学发病机制。⑸VD小鼠海马神经元CREB蛋白及mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致,提示CREB蛋白表达水平降低可能参与了VD的分子生物学发病机制。丁苯酞在改善VD小鼠学习和记忆成绩的同时,可显著减轻VD小鼠海马细胞内[Ca2+]i、CaMPKⅡ、NR2B、GluR2和CREB水平等方面的异常,从而发挥对VD的治疗作用,并且改善了海马组织CA1区病变,此与其学习和记忆成绩改善相一致。提示此药可能具有改善VD的药理学作用。
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