携带IBV基因重组质粒的大肠杆菌发酵及提取工艺研究

论文摘要

本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒真核表达质粒（pcDNA-S1、pcDNA—M、pcDNA—N）的重组大肠杆菌为研究对象,对其发酵工艺进行了研究。 采用单因子分析和正交设计,对重组大肠杆菌的摇瓶发酵工艺进行了研究,优化了装液量、培养温度、初始pH等培养条件,摇瓶发酵后,以碱裂解法提取质粒产量可达46.5mg/L,是未优化前质粒产量的6.8倍。 研究了携带禽传染性支气管炎病毒真核表达质粒基因工程菌在20L发酵罐中的发酵工艺。进行了分批发酵和补料发酵。结果表明,补料发酵在菌体量和质粒产量上均有增加。通过补料发酵,每小时补加80ml补料培养基,菌体密度（OD600）可达到43,以碱裂解法提取质粒产量达到76mg/L。所得质粒产量是分批发酵产量的1.6倍。与LB培养基相比,菌体浓度和质粒产量分别提高了40倍和27倍。 对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提,再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化,并对纯化条件进行了优化,建立了以碱裂解法粗提,硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质,提取的质粒DNA纯度可达到1.88,超螺旋比例达到98.4%,符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。完成整个操作只需90分钟,比PEG法纯化节省了5个小时。对发酵罐发酵的菌体以本工艺提纯,质粒产量可达到100mg/L。与离子交换法比较,生产成本降低了50%。 本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本,为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

论文目录

• 1、前言
• 1.1 禽传染性支气管炎的研究概况
• 1.2 大肠杆菌基因工程菌发酵工艺的研究进展
• 1.3 质粒DNA提取工艺的研究进展
• 1.4 存在的问题
• 1.5 本研究的前期工作基础
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2、技术路线
• 3、材料
• 3.1 质粒和菌种
• 3.2 培养基及试剂配方
• 3.3 主要仪器
• 4、方法
• 4.1 测定方法
• 4.2 携带 IBV基因重组质粒的大肠杆菌的鉴定
• 4.3 携带IBV基因重组质粒的大肠杆菌发酵工艺研究
• 4.3.1 摇瓶发酵培养基的筛选
• 4.3.2 摇瓶培养条件的筛选
• 4.3.3 发酵罐培养
• 4.4 质粒 DNA的提纯工艺研究
• 4.4.1 质粒粗提
• 4.4.2 质粒纯化
• 4.4.3 纯化质粒 DNA的质量评价
• 5、结果及分析
• 5.1 携带IBV基因重组质粒的大肠杆菌的鉴定
• 5.2 携带 IBV基因重组质粒的大肠杆菌发酵工艺研究
• 5.2.1 摇瓶发酵培养基筛选
• 5.2.2 摇瓶培养条件的筛选
• 5.2.3 发酵罐培养
• 5.3 质粒 DNA的提纯工艺研究
• 5.3.1 质粒粗提
• 5.3.2 质粒纯化
• 5.3.3 纯化质粒 DNA的质量评价
• 5.3.4 纯化后质粒 DNA的成本
• 6、讨论
• 6.1 携带 IBV基因重组质粒大肠杆菌发酵工艺的研究
• 6.1.1 发酵培养基
• 6.1.2 发酵培养条件
• 6.1.3 发酵方式
• 6.2 质粒提取工艺的研究
• 6.2.1 质粒粗提
• 6.2.2 质粒纯化
• 7、结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文