植物原生质体细胞骨架观察和兰花病毒的检测技术

论文摘要

蚕豆萎蔫病毒2（Bean broad wilt virus 2,BBWV 2）发生广泛,对许多经济作物造成严重危害。为了建立研究BBWV 2与寄主植物互作关系的实验体系,本文以防虫温室培育20～60d的豌豆幼嫩叶片为材料,进行了豌豆原生质体的分离培养研究,并对酶液配比、酶液pH、酶解时间、渗透压调节条件等作了探索。分离出的原生质体形态饱满浑圆,FDA测定活力良好。采用β微管蛋白一抗（鼠抗）和荧光基团FITC标记的兔抗鼠二抗标记感染BBWV 2和健康的豌豆原生质体微管骨架,用激光共聚焦显微镜进行了观察。用产自新鲜活体叶片的原生质体替代产自愈伤组织的原生质体,研究BBWV 2与寄主之间的互作,更接近事实原貌。研究中并未观察到感染BBWV 2后寄主细胞骨架的特异变化,可能病毒感染不造成寄主细胞骨架的变化,或者变化较小不易观察。建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）在兰花上大面积严重发生,对兰花的经济和观赏价值造成了不可估量的损失。本文研究了兰花上两种主要病毒的检测方法,并对其灵敏度及田间检测实用性进行比较。应用I-ELISA方法和电镜负染法对采自杭州、北京等地区多品系兰花上的CymMV和ORSV进行了检测,并分析比较了I-ELISA,DAS-ELISA和TAS-ELISA三种方法的灵敏度。数据表明两者发病率相似皆较高,但皆有无毒品系存在,应严格控制其传播,避免无毒品系染病。分析I-ELISA和DAS-ELISA及DAS-ELISA等方法所得数据表明,TAS-ELISA在三者之中检测灵敏度最高。应用抗CymMV单克隆抗体建立了快速检测田间样品的免疫斑点法（Dot-ELISA）和组织印迹法（Tissue blot-ELISA）,对其田间实用性进行了分析。CymMV单抗稀释3000倍时,Dot-ELISA中病叶粗汁液可被检出的最大稀释度为1:5120。Tissueblot-ELISA中样品一次平切后第1次印迹与Dot-ELISA样品1∶40稀释的结果相当,前4次印迹均可获得满意的显色效果。Tissue blot-ELISA的灵敏度低于Dot-ELISA,但Tissue blot-ELISA操作方便,更适宜田间应用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 原生质体分离、纯化和培养
• 1.1.1 原生质体在植物病毒学研究中的应用
• 1.1.2 原生质体分离
• 1.1.3 原生质体纯化与活力检测
• 1.1.4 原生质体培养
• 1.2 植物细胞骨架与植物病毒
• 1.2.1 植物细胞骨架
• 1.2.2 细胞骨架与病毒
• 1.3 兰花病毒检测
• 1.3.1 兰花起源、分布与价值
• 1.3.2 兰花主要病害
• 1.3.3 两种主要兰花病毒病害
• 1.3.4 植物病毒检测方法
• 1.4 研究内容及目的
• 第2章 豌豆原生质体分离、培养与细胞骨架标记
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 毒源
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 常用溶液和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 豌豆原生质体分离
• 2.2.2 豌豆原生质体纯化
• 2.2.3 豌豆原生质体培养
• 2.2.4 原生质体活力检测
• 2.2.5 原生质体微管骨架免疫荧光标记
• 2.3 结果
• 2.3.1 原生质体制备
• 2.3.2 微管骨架免疫荧光标记
• 2.4 讨论
• 第3章 兰花上两种主要病毒CYMMV和ORSV的检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒材料采集与保存
• 3.1.2 抗血清
• 3.1.3 常用缓冲液
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 兰花感染CymMV或ORSV后病症
• 3.2.2 电镜负染结果
• 3.2.3 I-ELISA、TAS-ELISA、DAS-ELISA的检测灵敏度
• 3.2.4 三种ELISA方法检测灵敏度比较
• 3.2.5 I-ELISA方法检测CymMV和ORSV的应用
• 3.3 讨论
• 3.3.1 三种ELISA方法检测CymMV灵敏度比较
• 3.3.2 I-ELISA在各地兰花样品检测中的应用
• 第4章 应用斑点法和组织印迹法检测CYMMV
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 检测对象
• 4.1.2 抗体
• 4.1.3 常用缓冲液
• 4.1.4 电镜负染法
• 4.1.5 免疫斑点法（Dot-ELISA）
• 4.1.6 组织印迹法（Tissue blot-ELISA）
• 4.1.7 提纯病毒不同稀释度检测
• 4.1.8 病叶粗汁液不同稀释度检测
• 4.1.9 病叶组织不同印迹次数检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 免疫斑点法、组织印迹法检测结果
• 4.2.2 免疫斑点法、组织印迹法和电镜观察法检测结果对比
• 4.2.3 CymMV、ORSV复合侵染病叶粗汁液梯度稀释Dot-ELISA检测结果
• 4.2.4 组织一次平切后不同印迹次数检测结果
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录A 常用溶液及缓冲液配方
• 附录B 固定液配方
• 附录C 原生质体MS培养基