前列腺特异性膜抗原增强子/启动子驱动EGFP特异性小干扰RNA在前列腺癌中表达的初步研究

论文摘要

目的：构建前列腺特异性膜抗原增强子／启动子（prostate-specific membrane antigen enhancer and promoter, pPSMAe/p）调控的靶向EGFP的shRNA真核表达重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA，探索前列腺特异性膜抗原增强子／启动子对前列腺癌细胞中shRNA表达的特异性驱动作用。方法：1．采用分子克隆技术将人工合成的含靶向EGFP的shRNA（EGFP-shRNA）及终止信号（polyA）序列的DNA片段定向插入含有PSMA增强子／启动子基因序列的质粒载体（pEGFPe／p），构建PSMA启动子／增强子靶向性调控的EGFP-shRNA真核表达重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA。2．脂质体介导转染重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA及报告基因表达质粒pEGFP-C1进入前列腺癌细胞系（LNCaP、PC-3、DU145）和非前列腺癌细胞系（MCF-7）。通过荧光表达来观察PSMAe／p在细胞中靶向调控EGFP-shRNA表达的作用。利用RT-PCR技术检测细胞转染后重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA对不同转染细胞中EGFP mRNA表达的影响。利用Western免疫印迹技术检测重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA对转染细胞中EGFP表达的影响。结果：1．成功构建前列腺特异性膜抗原增强子／启动子（PSMAe／p）靶向性调控的EGFP shRNA真核表达重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA，通过测序鉴定，基因序列完全正确。2．转染重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA及报告基因表达质粒pEGFP-C1进入各种细胞系后，仅有表达PSMA的LNCaP细胞系实验组中绿色荧光阳性细胞比率比对照组明显降低（P＜0.001），而不表达PSMA的PC-3、DU145和MCF-7等细胞系实验组绿色荧光阳性细胞比率与对照组无统计学差异（P＞0.05）。3．RT-PCR结果显示仅有LNCaP细胞系实验组EGFP mRNA水平比对照组明显降低（P＜0.001），而PC-3、DU145和MCF-7等细胞系实验组EGFP mRNA水平与对照组无统计学差异（P＞0.05）。4．Western免疫印迹结果显示仅有LNCaP细胞系实验组目的蛋白EGFP含量比对照组明显减少（P＜0.001），而PC-3、DU145和MCF-7等细胞系实验组目的蛋白EGFP含量与对照组无统计学差异（P＞0.05）。结论：成功构建了前列腺特异性膜抗原增强子／启动子靶向性调控的EGFP-shRNA真核表达重组质粒pPSMAe／p-siEGFP-polyA，并证实该重组质粒特异地干扰PSMA表达阳性前列腺癌细胞系中的EGFP基因的表达。初步证实了前列腺特异性膜抗原增强子／启动子对前列腺癌细胞中shRNA表达的特异性靶向驱动作用，为后续实验打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 文献综述
• 第一部分 重组质粒pPSMAe/p-siEGFP-polyA构建及鉴定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二部分 脂质体介导的pPSMAe/p-siEGFP-polyA表达载体对前列腺癌细胞系中EGFP表达的作用研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢