高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒N、M基因的克隆表达与应用研究

论文摘要

参照GenBank上公布的高致病性PRRSV毒株基因序列,设计了扩增N、M基因的特异性引物,并应用RT-PCR方法扩增出约372bp与约525bp目标基因片段。对扩增片段及pET-28a（+）与pBV220质粒分别用EcoRⅠ、SalⅠ两种酶进行消化,随后用T4DNA连接酶连接,将连接产物转化到BL21（DE3）LysS中,经双酶切鉴定与测序分析后表明已构建成功重组质粒pET（28a）N与pBV220M对N基因表达重组菌于37℃下培养至OD值0.5～0.6时用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明重组菌在诱导后可以表达特异性的N蛋白,该重组蛋白分子量约为17kD。将M基因表达重组菌30℃下培养至OD值0.4～0.6时迅速升温至42℃诱导4～6小时经SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明该重组菌在诱导后可以表达特异性的M蛋白,该重组蛋白分子量约为22kD。在以上实验基础上以重组N、M表达蛋白作为包被抗原,初步建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法。实验确定了N、M蛋白最佳抗原包被浓度分别为0.5μg/ml与1μg/ml,血清稀释度分别为1:40;经重复性试验、交叉试验、等试验,结果表明所构建的方法重复性好、特异性强、敏感度高;将建立的rN-ELISA、rM-ELISA方法与美国IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒相比较,其敏感性、特异性、和符合率经统计学分析,无显著性差异。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 病毒的分类地位
• 2 PRRSV理化特性
• 3 PRRSV生物学特征
• 4 PRRSV分子生物学研究进展
• 5 PRRSV的遗传变异
• 6 猪繁殖与呼吸综合征病毒的持续感染
• 7 PRRS疫苗研究进展
• 8 PRRS诊断方法研究进展
• 参考文献
• 第一章 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及表达
• 1、材料
• 2、方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 参考文献
• 第二章 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的克隆及表达
• 1、材料
• 2、方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 参考文献
• 第三章 以重组N、M蛋白为抗原的间接ELISA方法的初步构建
• 1、材料
• 2、方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附录A
• 附录B