人同源盒基因NKX3.1启动子的克隆及其调控区的鉴定

论文题目: 人同源盒基因NKX3.1启动子的克隆及其调控区的鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 姜安丽

导师: 张建业

关键词: 人同源框基因,基因表达调控,启动子,顺式作用元件,反式作用因子

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: NKX3.1是前列腺细胞特异表达的、受雄激素调节的同源盒基因,在前列腺胚胎发育、上皮分化及肿瘤发生发展中起重要作用。在胚胎形成过程中,Nkx3.1的表达可作为前列腺上皮分化的重要标志。Nkx3.1基因敲除的老鼠显示前列腺上皮发育不良、腺管形态异常和蛋白分泌障碍。表明Nkx3.1对于前列腺的正常发育及维持前列腺上皮的正常分化是必需的。更重要的是Nkx3.1基因敲除鼠随着年龄的增长,出现了类似于人前列腺上皮内瘤(intraepithelial neoplasia,PIN)的病理变化,表明Nkx3.1缺失可能与前列腺癌的起始有关。人同源盒基因NKX3.1位于染色体8p21,在前列腺上皮特异表达,其表达受雄激素调节。研究发现,NKX3.1在人前列腺癌发生发展中发挥重要的作用,约90%的前列腺肿瘤中存在染色体8p21区域的杂合缺失,NKX3.1即定位于此区域,认为NKX3.1在前列腺癌中可能作为抑癌基因发挥作用,它的表达缺失不仅与前列腺癌的起始及其进展有密切关系,而且决定了肿瘤发生的组织特异性。胚胎的发生与肿瘤的发生被认为是两个密切相关的过程。人同源盒基因NKX3.1是目前唯一已知参与前列腺的胚胎发育和前列腺癌发生两个过程的基因,因而NKX3.1基因的研究为进一步探讨前列腺的胚胎发育和肿瘤发生两个过程之间的关系以及同源盒基因在这两个过程的作用提供了一个理想的模式。关于人同源盒基因NKX3.1在前列腺发育和前列腺癌发生发展中的作用及其基因表达调控机制目前尚不完全清楚,有待于调查研究。本课题以人同源盒基因NKX3.1的基因表达调控为研究目标,克隆了人NKX3.1基因5’上游启动区1040bp片段并对其调控区域及其结合蛋白进行初步山东大学博士学位论文鉴定。为进一步阐明刀天火3.1在前列腺发育及肿瘤发生发展中的作用及其基因表达调控机制奠定基础。第一部分工作人同源盒基因八嗡伪3.1启动子的克隆及活性测定 研究目的:克隆人同源盒基因刀尤改3.1基因5’上游1040bp片段,测定其启动子活性,为进一步鉴定基本启动子及调控区域奠定基础。 研究方法和结果:l)首先根据基因数据库中的刃尤欠3.1基因5’上游序列,设计一对引物,利用PCR扩增刃尤改3.1基因5’上游IO4Obp启动子片段(+sbp至一1032bp),构建1040bp启动子一荧光素酶报道基因质粒(pGL3一1040)。经限制性内切酶切鉴定,克隆的启动子片段大小符合,插入方向正确。DNA测序结果正确。2)利用脂质体将pG与一1040质粒和内参照质粒pRL一TK共转染雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP,并检测荧光素酶报道基因的表达活性。双荧光素酶活性检测结果显示:1040bp片段具有明显的启动子活性,其活性为pGL3一eontrol启动子活性的1 .5倍,为pGL3一basie活性的50倍。3)万凡罚.1是受雄激素调节的基因,为了观察lo40bp启动子是否受雄激素调节,用10一,mol/L浓度的人工合成的雄激素R1881分别处理pGL3一1040转染的雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP和雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC一3M,检测荧光素酶活性。结果显示:LNCap细胞转染pGL3一1 040bp启动子后,加R1881处理sh后,可使1040bp启动子活性增加78%;在Pc一3M细胞的转染实验中,转染雄激素受体 (AR)表达载体,不加R1881处理,仅使启动子活性增加31%;而pGL3一IO4obp启动子和AR表达载体共转染加R1881处理,与pGL3一IO4Obp启动子与AR表达载体共转染组(无R1881处理)相比,可使启动子活性增加69%。说明雄激素在一定程度上调节lo40bp启动子的活性。其调节机制可能由AR介导。4)为了检测万凡钓.1一IO40bp启动子片段在不同组织细胞中的活性,构建了lo4obp启动子一绿色荧光蛋白报道基因质粒,利用脂质体分别转染不同的肿瘤细胞株(LNCaP、PC一3M、Hela、FCM一7、A549、SMMC7721、HT-29),荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达强度。结果:绿色荧光蛋白的表达在LNCaP细胞中最强,其余细胞系中也有不同程度的表达。此结果表明决定刀尤大3.1组织特异性表达的DNA序列可能在1 040bp片段的更上游或下游,需进一步鉴定。山东大学博士学位论文 结论:l)克隆的一o4obp片段位于刀犬万3.1基因上游+sbp至一1032bp区域;2)克隆的1040bp.刀尤$3.1启动子经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序,与基因库中的基因组序列比较,其序列正确:3)1040bp启动子片段构建到荧光素酶或绿色荧光蛋白报道基因上游,在前列腺癌细胞株LNcaP(表达NKX3.l)中显示有较强的启动子活性;4)1040bp-万龙$3.1启动子活性不具有明显的组织细胞特异性,但在前列腺癌细胞株LNCaP中活性最高。5)1 040bp启动子片段在一定程度上受雄激素调节,其调节机制可能由雄激素受体(AR)介导。第二部分工作刀无丫3.1基因启动子上游调控区域的鉴定 研究目的:在1040bP启动子片段内鉴定DNA调控区域,为进一步研究万凡粉.1基因表达调控奠定基础。 研究方法和结果:首先采用5’缺失突变技术,对104obP片段进行较大范围的5’系列缺失,构建一系列pGL3一1040bp缺失突变体,分别转染前列腺癌细胞株LNCaP,测定荧光素酶表达活性,观察缺失突变对启动子活性的彩响。结果显示:刀尤粉.1基因上游一lo32bp至一835bp片段的缺失,启动子活性降低了2.8倍,表明此区域可能存在正调控元件;一391bP至一212bP片段的缺失,?

论文目录:

中文摘要

英文摘要

符号说明

前言

第一部分 人同源盒基因NKX3.1启动子的克隆及活性测定

材料

试剂

主要仪器

方法

人基因组DNA的提取

NKX3.1基因5’上游1040bp启动子片段的PCR扩增及纯化

1040bp启动子片段的T-载体亚克隆

荧光素酶报道基因载体-NKX3.1启动子质粒的构建

绿色荧光蛋白报道基因-NKX3.1启动子质粒的构建

细胞的培养和转染实验

荧光素酶活性测定

结果

PCR扩增NKX3.1基因5’上游1040bp启动子片段及其T克隆鉴定

pGL_3-1040bp启动子质粒的鉴定及测序

pGL_3-1040bp启动子转染LNCaP细胞及双荧光素酶活性测定

雄激素类似物R1881对pGL_3-1040bp启动子活性的影响

pGL_3-1040bp启动子转染不同肿瘤细胞系及其启动子活性测定

pEGFP-1040bp启动子转染不同肿瘤细胞系及绿色荧光蛋白的表达

计算机转录因子数据库TRANSFAC分析

讨论

第一部分总结

第二部分 NKX3.1基因启动子上游调控区域的鉴定

材料

试剂

主要仪器

方法

荧光素酶报道基因-1040bp启动子缺失突变体的构建

细胞培养和转染实验

双荧光素酶活性测定

结果

1040bp启动子缺失突变体的酶切鉴定

缺失突变体的启动子活性测定

30bp负调控区在不同肿瘤细胞系中的活性

1040bp启动子缺失突变体的测序结果

讨论

第二部分总结

第三部分 NKX3.1启动子上游负调控区及其结合蛋白的鉴定

材料

试剂

主要仪器

方法

pGL3-399置换突变体的构建

30bp负调控区-异源启动子-荧光素酶报道基因质粒的构建

20bp负调控序列内缺失质粒的构建

细胞培养和转染实验

荧光素酶活性测定

核蛋白的制备

电泳迁移率变动分析

结果

pGL_3-399置换突变体酶切鉴定及测序

30bp负调控区置换突变对启动子活性的影响

30bp负调控序列对异源启动子活性的影响

计算机数据库TRANSFAC分析

EMSA鉴定30bp-负调控序列的特异结合蛋白

20bp-负调控序列内缺失对NKX3.1启动子活性的影响

负调控序列陷阱DNA对NKX3.1启动子活性的影响

讨论

第三部分总结

第四部分 未来研究工作的展望

参考文献

致谢

博士在读期间发表的论文目录

发布时间: 2005-06-14

参考文献

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