基于生物纳米技术从孕妇外周血分选FNRBC进行唐氏综合征诊断方法的研究

论文摘要

在我国,每年新生儿出生缺陷多达80万至120万例,出生缺陷发生率约为4%-6%。其中唐氏综合症是最常见的常染色体异常,目前新生儿的发病率为1/600-1/800,是引起先天性智力低下最主要的原因之一。由于唐氏综合征患者没有正常的生活能力,所以唐氏综合症患儿的出生,给家庭和社会带来了沉重的精神压力和经济负担。目前唐氏综合症缺乏有效的治疗方法,尽早进行产前筛查和诊断,发现后及时终止妊娠是降低唐氏综合症患儿出生率的有效途径。产前诊断是控制遗传病的发生,提高人口素质的一项重要措施。目前常规使用的羊水细胞法、绒毛细胞法及胎儿脐带血法等有创性产前诊断方法,对胎儿和孕妇都有一定的危险性,不易被孕妇所接受。而超声和血清学筛查的无创性产前诊断方法灵敏度和准确性较差。因此发展新的唐氏综合症无创性产前诊断方法具有重要的临床意义,一直是当前国际医学遗传学和生殖医学界关注的焦点之一生物纳米技术的发展为无创性产前诊断带来了希望的曙光。生物纳米技术是指利用纳米尺度的颗粒所特有的物理、化学性能以及其与细胞和分子的相互作用,开发高效和高灵敏度的检测、诊断和治疗疾病的技术。其中磁性纳米颗粒的磁性分选技术和荧光量子点的标记技术已被广泛应用到生物医学领域。孕妇外周血中的胎儿有核红细胞的发现为无创性产前诊断方法提供新的途径。但胎儿有核红细胞在孕妇外周血中数目稀少,如何富集纯化这些细胞从而成为研究的热点。目前常用的分离富集方法主要有密度梯度离心法、磁激活细胞分选法、荧光激活的细胞分选法、单细胞的显微操作法、胎儿细胞培养富集法等。其中抗转铁蛋白受体（CD71）的抗体是最常用的分离孕妇血中胎儿有核红细胞的特异性抗体。目前常用于胎儿有核红细胞磁性分离的免疫磁珠主要是直接或间接地与抗CD71抗体相连的Dynal公司生产的大磁珠（直径约4.51μM）或是Miltenyi生产的小磁珠（直径约50nM）。但这两种磁珠都有自身无法克服的缺点,且均为国外所生产,价格昂贵。而直径约150nM的磁性纳米粒子由于具有偶联容量高,超顺磁性和易于与生物分子相偶联等优点备受人们的青睐。抗CD71抗体不仅结合胎儿有核红细胞,还结合母体部分激活淋巴细胞、网织红细胞等,所以需要对CD71阳性的细胞进行胎儿源性鉴定。较常用的鉴定方法包括：对Y染色体特异序列进行PCR扩增或用特异探针进行FISH分析。但这两种方法只能鉴定出NRBC来源为男性的胎儿。此外,可使用免疫细胞化学法或免疫荧光法对胎儿特异性血红蛋白进行鉴定,但灵敏度低,特异性差,结果总不尽人意。本研究利用与抗CD71单抗相偶联的磁性纳米颗粒对孕妇外周血胎儿有核红细胞进行磁性分选,并进一步用荧光量子点的标记技术对分选的胎儿有核红细胞进行鉴定,最后用灵敏度较高的实时定量PCR方法对唐氏综合征进行初步的诊断。实验取得如下进展：1.在优化的条件下,通过不同的密度梯度离心方法分离新生儿脐血的有核红细胞,结果Percoll 1.090单倍密度梯度离心法富集的数量最多,每m1新生儿脐血可富集170.58±5.67×104个有核红细胞,纯度较高,每2000个总细胞中有129个左右的有核红细胞；并且进一步应用Percoll 1.090单倍密度梯度离心法成功富集到孕妇血胎儿有核红细胞。该方法简便、快速,富集到的胎儿有核红细胞形态完整,为下一步的实验奠定基础。2.通过EDC化学偶联法将磁性纳米颗粒与抗CD71抗体共价偶联,并进一步通过透射电镜观察到偶联后的磁性纳米颗粒分散均匀；用考马斯亮蓝法测定优化条件后蛋白偶联率达到44.28±1.74%;用FITC一二抗检测到偶联后的抗体仍有活性；细胞结合能力实验表明偶联物能分离富集新生儿脐血中的有核红细胞；新生儿脐血模型检测偶联物分离效率达到25.19±10.15%。成功建立了抗CD71抗体纳米免疫磁性颗粒的制备方法,为孕妇外周血中微量胎儿有核红细胞的分离富集奠定了基础。3.采用改进水相法在水溶液中直接合成了经过巯基丙酸修饰的水溶性CdTe荧光量子点,通过荧光发射光谱和吸收光谱等系列表征观察,结果表明该水溶性CdTe量子点荧光发射光谱窄而对称,吸收光谱范围较宽；通过EDC法将水溶性CdTe荧光量子点与抗胎儿特异性血红蛋白抗体相偶联,偶联物能对新生儿脐血中的有核红细胞特异性标记；荧光稳定性实验中,激发光连续照射30分钟,荧光强度没有明显改变；并且该偶联物成功标记了磁性富集后的有核红细胞。在国际上首次成功应用两种纳米粒子-磁性纳米颗粒和量子点对孕妇外周血胎儿有核红细胞进行磁性分离和量子点荧光鉴定,为孕妇外周血中微量胎儿有核红细胞的唐氏综合征无创性诊断奠定了基础。4.用痕量基因组DNA提取试剂盒提取经过磁性富集量子点鉴定的孕妇外周血中胎儿有核红细胞的DNA,用实时定量PCR方法检测样品基因组DNA的唐氏综合征关键区域与阳性对照的相对定量,结果所检测的这7例样本均在在正常范围内,该诊断结果与临床羊水中的细胞核型分析相吻合。成功建立了应用实时定量PCR对孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行唐氏综合征进行初步诊断的方法。本研究建立了一种基于生物纳米技术从孕妇外周血分选胎儿有核红细胞从而进行唐氏综合征无创性产前诊断的方法,如果这种方法可行并能成功应用于临床,必将使未来的产前诊断更加安全、简便、快速和普及,从而对降低我国新生儿出生缺陷发生率、提高出生人口素质产生积极实用的深远影响。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一篇 绪论
• 第二篇 实验研究
• 第1章 抗CD71单抗纳米免疫磁性颗粒的制备及对有核红细胞的富集
• 第1节 不同的密度梯度离心方法富集有核红细胞的比较
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2节 抗CD71单抗纳米免疫磁性颗粒的制备及对有核红细胞的富集
• 2.1 材料
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第2章 水溶性CdTe荧光量子点对FNRBC的标记
• 第1节 水溶性CdTe荧光量子点对新生儿脐血中NRBC的标记
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 方法
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 1.6 小结
• 第2节 磁性纳米粒子富集及荧光量子点鉴定孕妇血FNRBC方法的研究
• 2.1 材料
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第3章 应用实时定量PCR方法对孕妇外周血FNRBC进行唐氏综合征基因诊断的研究
• 3.1 材料
• 3.2 仪器
• 3.3 方法
• 3.4 结果
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 结论
• 第三篇 文献综述
• 综述1 孕妇外周血胎儿细胞的分离及其在产前诊断中的应用
• 1.1 孕妇外周血胎儿细胞的种类
• 1.2 胎儿细胞在孕妇外周血中的数量、出现的时机及滞留时间
• 1.3 胎儿细胞的分离富集方法
• 1.4 胎儿细胞的鉴定方法
• 1.5 孕妇外周血中胎儿细胞在产前诊断中的应用
• 1.6 问题和展望
• 综述2 量子点在生物医学领域的应用
• 2.1 量子点的独特性质
• 2.2 量子点的表面修饰及其与生物大分子的偶联
• 2.3 量子点在生物检测方面的应用
• 2.4 量子点在体内成像方面的应用
• 2.5 前景及展望
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢