活性粘细菌的筛选及产物分离鉴定

论文摘要

20世纪五十年代，人们发现粘细菌（myxobacteria）能够产生抗生素类物质，此后具有生物学活性的粘细菌的分离筛选就成为人们的研究热点之一，尤其是从粘细菌中发现、分离及鉴定新的抑菌、抗肿瘤化合物。本论文首先对实验室保藏的16株粘细菌进行摇瓶发酵，提取其粗产物，采用滤纸片法、生长速率抑制法进行抑菌活性筛选，采用MTT法进行抗肿瘤活性筛选。结果显示，菌株m03粗产物的抑真菌效果最好，抑菌谱较宽，对白色念珠菌、酿酒酵母、烟曲霉、根霉、黑曲霉、青霉、毛霉的抑菌直径分别为14.5mm、12.3mm、8.8mm、14.0mm、10.2mm、13.3mm、11.3mm，对纹枯病原菌和稻瘟霉的抑制率为72.4%和69.3%；菌株m01粗产物的抑细菌活性最好，能够较好的抑制肠炎杆菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的生长，抑菌圈直径分别为9.6mm、9.8mm、10.2mm、10.2mm、21.4mm，菌株m11、m01和m16对白血病癌细胞K562抑制活性较强，其IC50值分别为11μg/mL、21μg/mL和21μg/mL。随后我们对抑真菌活性最高的菌株m03和抗肿瘤活性最高的菌株m11进行固体平板和液体摇瓶培养，通过液体培养形态、固体菌落形态、细胞形态等形态学特征及生理生化实验，并结合16S rDNA分子生物学序列分析，最终确定菌株m03为橙色粘球菌（Myxococcus fulvus），菌株m11为粘球菌属（Myxococcus.sp）。分析了两菌株的生长特性，考察了两菌株的生长曲线，确定两菌株的最佳培养条件为：玉米淀粉、酵母浸粉、添加生长因子维生素B12，无机盐选择硫酸镁，最适pH值8.0，最适培养温度为30℃，转速140r/min，接种量10%，种龄56h，装液量60mL（300mL三角瓶）。我们进一步对菌株m03进行大规模发酵，提取粗产物，通过硅胶柱、凝胶柱、反相柱等多种层析分离手段，对粗产物进行分离纯化，最终得到5个化合物M1-M5，并通过核磁共振、质谱等波谱手段进行结构鉴定，发现它们均为已知化合物：M1，quinolin-4-ylmethanol；M2，myxothiazol；M3，4-quinolinecarboxaldehydeoxime；M4，N-（2-phenylethyl）acetamide；M5，N-acetyltyramine，资料显示化合物myxothiazol抑真菌效果较好，具有一定的开发价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 粘细菌次级代谢产物的特点
• 1.2 粘细菌活性次级代谢产物作用机制
• 1.2.1 抑制核酸合成
• 1.2.2 电子传递抑制
• 1.2.3 抑制蛋白合成
• 1.2.4 细胞骨架抑制剂
• 1.2.5 蛋白质磷酸化系统干扰剂
• 1.2.6 金属离子螯合剂
• 1.2.7 干扰糖类代谢
• 1.2.8 作用于细胞壁
• 1.2.9 抗病毒活性
• 1.3 粘细菌抑菌化合物研究进展
• 1.4 粘细菌抗肿瘤化合物研究进展
• 1.5 本课题的立题依据、目的和研究意义
• 1.6 本课题的研究内容
• 第2章 抑菌活性粘细菌的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验仪器及试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 粘细菌活化
• 2.2.2 粘细菌发酵
• 2.2.3 粘细菌粗产物提取
• 2.2.4 菌悬液的制备
• 2.2.5 抑菌实验
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 抑真菌病原菌粘细菌的筛选
• 2.3.2 抑细菌病原菌粘细菌的筛选
• 2.4 本章小结
• 第3章 抗肿瘤活性粘细菌的筛选
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验细胞株
• 3.1.2 实验仪器及试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粘细菌粗产物浓度梯度制备
• 3.2.2 肿瘤细胞的复苏
• 3.2.3 肿瘤细胞的传代培养
• 3.2.4 IC50测定
• 3.2.5 计算抑制率
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 抗乳腺癌细胞 Mcf-7 粘细菌的筛选
• 3.3.2 抗宫颈癌细胞 HELA 粘细菌的筛选
• 3.3.3 抗白血病细胞 K562 粘细菌的筛选
• 3.4 本章小结
• 第4章 两种粘细菌的鉴定及生长特性研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 实验仪器及试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 形态学特征观察
• 4.2.2 生理生化实验
• 4.2.3 16S rDNA 鉴定
• 4.2.4 菌体生长曲线测定
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 菌株形态学观察结果
• 4.3.2 生理生化实验结果
• 4.3.3 16S rDNA 鉴定结果
• 4.3.4 菌株生长特性研究
• 4.4 本章小结
• 第5章 橙色粘球菌 m03 次级代谢产物的分离纯化及结构鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 实验仪器及试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 种子液制备
• 5.2.2 粘细菌发酵
• 5.2.3 粘细菌粗产物的提取
• 5.2.4 LH-20 凝胶柱层析
• 5.2.5 薄层层析
• 5.2.6 硅胶柱层析
• 5.2.7 C18 反相柱层析
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 橙色粘球菌 m03 发酵及产物粗分离
• 5.3.2 产物精分离
• 5.3.3 产物结构鉴定
• 5.4 本章小结
• 第6章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间主要科研成果