论文摘要
目的:熊果酸（ursolic acid,UA）是存在于天然植物和药物中的一种三萜类化合物,具有广泛的生物学效应。许多学者研究了熊果酸的抗肿瘤、抗炎和免疫调节功效。但到目前为止熊果酸对T细胞功能的影响尚不明确。T细胞是淋巴细胞的主要组分,是免疫识别、应答以及调控的主要细胞,在免疫系统处于主导地位,T细胞活化在正常的免疫应答和病理性免疫应答中起着关键性作用。类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以多关节滑膜慢性炎症导致关节软骨进行性破坏,大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见自身免疫性疾病。RA的病理和病因包括了自身抗原的异常呈递和自身反应性T细胞的激活。一般认为RA的慢性炎症是由抗原诱导T细胞活化,促使T细胞向滑膜浸润引起炎症反应,从而进一步导致滑膜增生和血管翳产生及软骨、骨的吸收。RA伴随着T细胞过度增殖,关节滑膜液淋巴细胞活化标志CD69、CD25、CD71、HLA-DR表达增高,血清中Th1/Th2细胞分泌的细胞因子存在明显失衡。虽然,RA的发病机制至今不明,但是研究淋巴细胞活化及其信号传递异常,改变细胞信号异常传递,平衡促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的分泌,进而阻断淋巴细胞的过度激活,将为临床诊断和治疗RA提供新的思路。因此,以小鼠体外T淋巴细胞模型为研究对象,寻找具有免疫调节作用的中药成分,为治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病筛选有效中药,具有一定的实际意义。CD69,CD25,CD71在T细胞中的表达均与T细胞增殖相关。IL-2、IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2反应的代表,检测IL-2、IFN-γ和IL-4,可反应Th1/Th2平衡状况。NF-κB在炎症和自身免疫性疾病的病理机制中发挥重要的免疫学作用,从而导致类风湿性关节炎等疾病的发展。NF-κB活化的抑制剂可能有效治疗自身免疫性和炎性疾病。中药复方痹肿消汤由白花蛇舌草、藤梨根、络石藤等组成,是治疗类风湿性关节炎的有效方剂,而熊果酸是其中多种中药的主要活性成分。先前的研究证明熊果酸具有明显的抗炎作用,能改善胶原诱导的关节炎小鼠的症状,但机制并不清楚。本研究探讨了熊果酸体外对T淋巴细胞增殖、激活、细胞因子表达以及NF-κB信号通路的影响,为熊果酸对类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和炎症性疾病的临床治疗提供实验依据。方法:为了探讨熊果酸的免疫调节作用,我们研究了体外熊果酸对T淋巴细胞增殖、激活,细胞因子表达以及NF-κB信号通路的影响。首先,采用MTT法检测熊果酸对ConA或PMA加Ion诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响;其次,采用流式细胞术检测熊果酸对PMA诱导的T细胞表面分子CD69、CD25、CD71表达的影响;第三,采用RT-PCR方法验证熊果酸对PMA加Ion诱导的T淋巴细胞Th1/Th2细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4mRNA表达的影响;第四,采用ELISA法测定熊果酸对PMA加Ion诱导的T淋巴细胞分泌IL-2水平的影响。第五,采用Wersten blot方法检测熊果酸对PMA激活T淋巴细胞IκB-α磷酸化和NF-κB P65入核的影响。结果:（1）MTT比色法结果显示熊果酸（5-30μM/L）能剂量依赖性地抑制ConA或PMA加Ion诱导的小鼠淋巴细胞增殖。（2）流式细胞术检测结果显示熊果酸（10-30μM/L）能剂量依赖性地减少PMA激活后T细胞CD3+CD69+、CD3+CD25+、CD3+CD71+阳性率。（3）RT-PCR检测结果显示熊果酸（5-30μM/L）能剂量依赖地降低PMA加Ion诱导的T细胞IL-2和IFN-γ（Th1）、IL-4（Th2）mRNA表达。（4）ELISA法检测结果显示熊果酸能剂量依赖地抑制PMA加Ion刺激下T细胞分泌IL-2。（5）Western blot方法检测到PMA激活T细胞后NF-κB的入核以及IKBα的磷酸化能被熊果酸（10-20μM/L）抑制。结论:（1）熊果酸能抑制小鼠T细胞被异常激活与增殖。（2）熊果酸对T细胞功能的抑制机理可能与NF-κB信号通路有关。