论文摘要
目的建立骨髓间充质干细胞体外培养及扩增体系的基础上,探讨不同时期移植BMSC、移植时间长短以及移植途径不同对大鼠肝纤维化进程的影响:从TGF-β1的角度出发,探讨BMSC移植在肝纤维化进程中的作用机制以及可能在肝硬化后肝癌发生中的影响。方法1、应用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化雄性SD大鼠BMSC,分别向成骨细胞,成脂肪细胞诱导分化进行鉴定。2、在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型的第六周、第八周,将来自雄性SD大鼠的BMSC以5×106/只的剂量经尾静脉注入同种雌性大鼠体内。分别在BMSC移植4周及6周后处死各组大鼠,评价干预组与对照组的生存状态,并用Scheuer炎症活动度评分法和Schmid M纤维化评分法评价肝脏病理情况。3、在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型的第六周,将来自雄性SD大鼠的BMSC以5×106/只的剂量经腹腔、经尾静脉及肝内注射三种途径移植入同种雌性大鼠体内。BMSC移植6周后分别处死各组大鼠,评价各组的生存状态,异形细胞发生率,Scheuer炎症活动度评分法和Schmid M纤维化评分法评价肝脏病理情况,免疫组化法检测α-SMA评价肝星状细胞（HSC）活化情况。4、在建立四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型与二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine.DEN）诱发性大鼠肝癌模型基础上,分析TGF-β1及其信号转导蛋白在MSC移植减轻纤维化中的作用以及减少异形细胞发生从而可能对肝硬化后肝癌发生的影响。结果第一部分:利用密度梯度离心法结合MSC塑料贴壁生长的特性,从成年大鼠骨髓中分离、扩增培养获得形态均一的细胞集落。并在体外不同的诱导条件下,将MSC诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,间接证明了本实验从骨髓中分离得到的细胞为MSC。第二部分:第六周移植BMSC,移植4周后处死的对照组和干预组在炎症活动度方面无明显差异,Scheuer评分均值分别为3.73和3.58（u=-0.421,P=0.853）,但在纤维化方面,Schmid M评分均值分别为5.54和4.75（u=-2.173,P=0.041）。第六周移植BMSC,移植6周后处死的对照组与干预组,Scheuer评分均值分别为3.58和0.42（u=-4.218,P＜0.01）,Schmid M评分均值分别为5.17和1.58（u=-3.653,P＜0.01）。第六周移植BMSC,移植4周和6周后处死的两组大鼠,Scheuer评分均值分别为3.58和0.42（u=-4.214,P＜0.001）;Schmid M评分均值分别为4.75和1.58（u=-3.79,P＜0.011）。第八周移植BMSC,移植4周后处死的对照组和干预组在炎症活动度与纤维化评分方面均无明显差异,Scheuer评分均值分别为3.58和3.64（u=-0.421,P=0.860）,Schmid M评分均值分别为5.17和5.27（u=-0.352,P=0.732）。第六周与第八周移植BMSC,均在造模12周后处死的两组大鼠间,Scheuer评分的均值分别为0.42和3.64（u=-4.146,P＜0.01）;Schmid M评分均值分别为1.58和5.27（U=-3.88,P＜0.01）。第三部分:第六周移植BMSC,移植6周后处死的模型组与各干预组在生存率上无明显差异。在腹水发生率上,模型组与经尾静脉干预组有显著差异。模型组和经腹腔移植干预组在炎症活动度、纤维化以及肝星状细胞活化程度上均无明显差异,Scheuer评分均值分别为3.58和2.40（u=-1.58,P=0.11）,Schmid M评分均值分别为5.17和4.70（u=-0.82,P=0.41）,α-SMA评分均值分别为2.25和1.50（u=-1.37,P=0.17）。模型组与经尾静脉移植干预组和肝内移植干预组在炎症活动度、纤维化以及肝星状细胞活化程度上均有显著差异,Scheuer评分均值分别为3.58、0.42和1.27（u=-4.22,P＜0.01;U=-3.13,P＜0.01）;Schmid M评分均值分别为5.17、1.58和3.00（u=-3.65,P＜0.01;u=-2.54,P＜0.01）;α-SMA评分均值分别为2.25、0.58和0.55（u=-2.93,P＜0.01;u=-3.11,P＜0.01）。各治疗组间进行两两对比结果显示:经腹腔干预组与经尾静脉干预组在炎症活动度、纤维化评分上以及α-SMA的表达上均有显著差异（P＜0.05）;经尾静脉干预组与肝内干预组在炎症活动度、纤维化评分以及肝星状细胞活化方面均无明显差异。而经腹腔干预组与肝内干预组在炎症活动度、纤维化评分上无显著差异（P＞0.05）,但在肝星状细胞活化方面有显著差异（u=-2.43,P=0.02）。模型组异形细胞发生率为50%,经腹腔干预组为30%,经尾静脉干预组为0%,肝内干预组为9.1%。模型组与各干预组间在发生率上均有显著差异。第四部分:在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型中,模型组与干预组在肝脏炎症活动度、纤维化程度及HSC的活化情况上有显著差异,Scheuer评分均值分别为3.58和0.42（u=-4.22,P＜0.01）,Schmid M评分均值分别为5.17和1.58（u=-3.65,P＜0.01）,α-SMA评分均值分别为2.25和0.58（u=-2.93,P＜0.01）。异形细胞发生率在模型组为50%,干预组为O%（P＜0.05）。TGF-β1含量在两组间也有显著差异（F=11.024,p=0.029）,而两组间TGF-β1信号传导蛋白smad4和smad7无明显差异（F=0.178,p=0.695,F=0.00,p=0.986）。在二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱发性大鼠肝癌模型中,BMSC移植可以抑制细胞周期（G1期P=0.000,G2期P=0.000,S期P=0.000）,但不能减少肝癌发生（63.64%和33.36%,x2=2.112,P=0.22）,不能减轻肝脏炎症活动度、纤维化程度及HSC的活化,Scheuer评分均值分别为1.82和1.75（u=-0.39,P=1.00）,Schmid M评分均值分别为5.91和5.83（u=-0.58,P=0.86）,α-SMA评分均值分别为2.00和2.67（u=-1.08,P=0.29）。TGF-β1及smad4、smad7的含量在两组间亦无差异（F=1.538,p=0.283,F=4.989,p=0.298,F=2.698,p=0.176）。结论1、密度梯度离心法结合贴壁培养法适合于分离纯化MSC,可满足组织工程研究对大量细胞的需求。2、肝纤维化形成早期移植BMSC可以减轻CCL4引起的肝脏炎症程度,改善大鼠的肝纤维化程度,且与移植时间成正相关。3、经腹腔移植BMSC对大鼠肝纤维化进程无显著影响;经尾静脉与肝内移植BMSC均可显著减轻肝纤维化大鼠肝脏的炎症与纤维化程度;BMSC移植可以减少肝星状细胞的激活,减少肝纤维化进程中异形细胞发生率。4、本研究提示,BMSC移植可能是通过抑制TGF-β1的分泌,减轻炎症程度,减少肝星状细胞激活进而减缓肝纤维化进程。在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型中,BMSC可能通过减少TGF-β1含量调控细胞周期,进而减少异形细胞,但在二乙基亚硝胺诱发性大鼠肝癌模型中,对细胞周期的抑制作用并非通过TGF-β1途径。
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