大鼠精子ZP3结合蛋白sp56缺失肽的原核表达、纯化及其抗体的制备

论文摘要

哺乳动物卵透明带糖蛋白ZP3（zona pellucida 3）是介导精卵初级结合,诱发精子发生顶体反应的关键分子。目前已在精子中发现多种ZP3 结合蛋白,其中小鼠精子蛋白sp56 被认为是小鼠ZP3 的受体候选者之一。至今,小鼠sp56 的同源物只有从豚鼠睾丸中克隆到的AM67。根据本实验室已有的研究基础,在大鼠精子中有两个转录本——sp56l 和sp56s。sp56l 编码的蛋白与小鼠sp56 与豚鼠AM67 高度同源,都含有7 个Shshi结构域,而sp56s 编码的蛋白前体则完全缺失了第三个Shshi 结构域。本研究根据sp56l 上第三个Shshi 结构域设计两条引物,以本实验室已构建的大鼠sp56l 的cDNA 载体为模板PCR 扩增出sp56-lost 片段,通过pGEX-4T-3 上的多克隆酶切位点,把两个sp56-lost 片段串联起来定向克隆到pGEX-4T-3 载体上。用IPTG 诱导原核表达,筛选后,用谷胱甘肽-琼脂糖树脂亲和纯化,得不到可溶目的蛋白。为了能在变性条件下亲和纯化出目的蛋白,换用PET-32a 载体,同样用IPTG 诱导原核表达,筛选后用Ni-NTAHis-Bind 树脂在变性条件下亲和纯化出了目的蛋白。变形条件下亲和纯化所得的目的蛋白进行SDS-PAGE 电泳后,切下目的蛋白条带,剪碎后冻干,磨成粉末和完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混合后免疫兔子四次,免疫三次后从兔耳缘静脉取血做ELISA,得抗血清效价,再从兔颈动脉放血收集抗血清。本工作成功制备了大鼠sp56s 缺失肽（sp56-lost）的抗体,为进一步研究大鼠sp56两种变异体的功能和分布奠定了基础,同时本次实验得到的sp56s 缺失肽抗体能为以后精卵结合过程的研究提供一个很好的时空定位标记。

论文目录

• 中文摘要（Chinese Abstract）
• 英文摘要（English Abstract）
• 第一部分 综述（Summarization）
• 哺乳动物受精过程的研究进展（Advances in studies of mammals fertilization process）
• 参考文献A（Reference A）
• 第二部分 实验（Experiment）
• 大鼠精子ZP3 结合蛋白SP56 缺失肽的原核表达、纯化及其抗体的制备（Prokaryotic expression, purification and antibody production of sp56-lost of rat sperm ZP3 binding protein sp56）
• 前言（Reference）
• 2融合蛋白的原核表达及其纯化（Prokaryotic expression and affinity purification of GST-（sp56-lost）2 fusion protein）'>实验一 GST-（sp56-lost）₂融合蛋白的原核表达及其纯化（Prokaryotic expression and affinity purification of GST-（sp56-lost）2 fusion protein）
• 2-His 融合蛋白的原核表达及其纯化（Prokaryotic expression and affinity purification of Trx-（sp56-lost）2-His fusion protein）'>实验二 Trx-（sp56-lost）₂-His 融合蛋白的原核表达及其纯化（Prokaryotic expression and affinity purification of Trx-（sp56-lost）2-His fusion protein）
• 实验三 sp56-lost 抗血清的制备（Production of polyclonal antisera of sp56）
• 参考文献B（Reference B）
• 致谢（Acknowledgment）
• 论文独创性声明
• 论文使用授权声明