康泰胶囊对内脏高敏感性模型大鼠的治疗作用及机制

论文摘要

肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）是一种功能性疾病,主要症状为腹痛或腹部不适,且伴有排便习惯改变,其发病机理迄今尚不明确,现在普遍认为是多种因素综合作用的结果,其中心理、精神、社会和环境等因素在发病过程中起重要作用,同时受神经系统、免疫系统和内分泌系统的制约,导致肠道平滑肌运动障碍和内脏感觉异常。IBS病因及发病机制复杂,现代医学以对症治疗为主,目前仍缺少理想的药物。中药具有整体调节、多靶点及副作用小的优势。肝郁脾虚、心胃不和是IBS临床表现最多的证型之一,临床采用疏肝健脾、和胃安神的治法及方药治疗取得良好的疗效。康泰胶囊为脾胃研究所周福生教授的经验方,具有疏肝健脾,和胃安神的功效,经多年临床实践证实治疗IBS,尤其是腹泻型IBS疗效确切,安全无毒。内脏高敏感性是IBS的主要特征之一,是导致腹痛及胃肠道运动异常的主要原因,其表现为内脏肠道对气囊扩张后感觉阈值的改变。临床表现为IBS患者对结肠镜及结肠气囊扩张的疼痛阈值要比对照组显著降低,较易感到腹痛;实验方面表现为大鼠肠道结直肠扩张后抬腹与拱背的压力阈值降低,明显低于正常组。本课题根据不同病因复制两种内脏高敏感大鼠动物模型,探讨康泰胶囊对该模型的治疗作用。并以内脏高敏感性的效应器肠道为对象,研究康泰胶囊对肠道递质5-HT、NO、SP、CGRP及受体5-HT和CRF表达的影响,以探讨康泰胶囊发挥治疗作用的机理。本研究不仅可为新药开发提供实验依据,而且对阐明中药治疗IBS的机理具有重要意义,同时这一研究将使中医药治疗IBS的机理研究深入到基因调控水平,对于开发抗IBS中药新药的有着重要的理论意义和广阔的应用前景。1康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠治疗作用脾胃研究所在临床经验的基础上,以疏肝健脾,和胃安神为治则,总结出治疗肠易激综合征的中药复方康泰胶囊,临床疗效显著。为从实验角度阐明疗效,并进一步探讨其作用机理,我们复制乙酸法及母子分离应激法两种内脏高敏感性大鼠模型,并在此模型上观察了康泰胶囊的治疗效果。康泰胶囊采用三个剂量给药治疗,阳性组用泽马可治疗,并设阴性组（模型组）及正常对照组,治疗结束后引起大鼠抬腹和拱背时的压力阈值为指标,评估药物对内脏高敏感性的作用。结果表明:两种内脏高敏感性模型大鼠直肠扩张后抬腹和拱背的压力阈值均显著降低（P＜0.01）;经过药物治疗后,康泰胶囊低、中、高剂量组动物抬腹和拱背的压力阈值均明显高于模型组（P＜0.01）,且高剂量组已恢复到接近正常水平,提示康泰胶囊对两种模型大鼠内脏高敏感性有改善作用。为了进一步评估康泰胶囊对母子分离应激大鼠在成年时复合急性应激时的作用,在康泰胶囊治疗母子分离应激大鼠两周后,随后复合急性避水应激。以大鼠站立于平台上1小时内的排便粒数作为指标,评价康泰胶囊对大鼠结肠运动紊乱的防治作用;直肠扩张评价康泰胶囊对大鼠内脏高敏感性的作用。结果表明:母子分离应激复合急性水应激大鼠排便粒数明显多于正常对照组（P＜0.01）;经过药物治疗后,康泰胶囊低、中、高剂量组排便粒数显著少于模型组（P＜0.01）。大鼠抬腹和拱背的压力阈值明显低于正常对照组（P＜0.01）。经过药物治疗后,康泰胶囊低、中、高剂量组抬腹和拱背的压力阈值显著高于模型组（P＜0.01）,提示康泰胶囊对于母子分离应激复合应激诱导的排便异常与内脏高敏感性有防治作用。2康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠NO及5-HT水平的影响内脏高敏感性形成机制复杂,目前尚未有定论。在肠道5-HT与NO参与了内脏高敏感性形成。NO是近年发现的重要生物活性物质,可介导平滑肌松弛效应,在胃肠道感觉与蠕动过程产生抑制作用。5-HT是一种广泛存在于胃肠道、血及脑内的神经递质,可以调节中枢感觉、胃肠道的感觉及运动。我们在康泰胶囊治疗实验性内脏高敏感性作用的基础上,研究了该药对血清、肠、脑中5-HT及血清中NO的作用。采用康泰胶囊三个剂量对两种大鼠内脏高敏感性模型大鼠进行治疗,治疗结束采血,制备血清样本,处死动物取结肠与脑组织,采用硝酸还原酶法测血清NO及荧光分光光度法测5-HT含量。结果表明:乙酸法内脏高敏感性模型大鼠血清NO明显低于正常对照组（P＜0.05）;经过药物治疗后,康泰胶囊低、中、高剂量组血清NO显著高于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。乙酸法内脏高敏感性模型大鼠血清、脑、结肠5-HT含量显著高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）;经过药物治疗后,康泰胶囊中、高剂量组血清5-HT含量显著低于模型组（P＜0.01）;康泰胶囊低、中、高剂量组脑5-HT含量低于模型组（P＞0.05）;康泰胶囊低、中、高剂量组结肠5-HT含量显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。母子分离法内脏高敏感性模型大鼠血清NO含量明显低于正常对照组（P＜0.05）;经过药物治疗后,康泰胶囊低、中、高剂量组血清NO显著高于模型组（P＜0.01）。模型大鼠血清、脑、结肠5-HT含量明显高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）;经过药物治疗后,康泰胶囊高剂量组血清5-HT含量为1823.17±203.78ng/ml,显著低于模型组（P＜0.05）;康泰胶囊低、中、高剂量组脑5-HT含量低于模型组（P＞0.05）;康泰胶囊低、中、高剂量组结肠5-HT含量显著低于模型组（P＜0.01）,提示康泰胶囊能显著提高两种内脏高敏感性模型大鼠血清NO含量,显著降低血清、结肠5-HT含量,一定程度降低脑5-HT含量;对模型大鼠NO、5-HT的调节作用是其治疗内脏高敏感性作用的机理之一。3康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT、P物质、CGRP、CRF的影响近年来随着对肠道多种胃肠激素的深入研究,正逐步揭示着的内脏高敏感性形成的机制,特别是P物质、CGRP、CRF在肠道表达及相互作用已成为众多学者研究的方向。5-HT、P物质与CGRP在肠道可直接作用于初级传入纤维诱发内脏高敏感性;CRF作为神经递质作用于外周神经感受器,产生内脏感觉异常。为探讨康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠的作用机理,我们观察了该药对乙酸法内脏高敏感性模型结肠粘膜P物质,5-HT、CGRP及母子分离法内脏高敏感性模型结肠粘膜5-HT、CRF的作用。采用三个剂量对两种内脏高敏感性大鼠模型进行治疗,治疗结束后固定结肠组织,切片进行免疫组化染色,光镜下分别计数P物质,5-HT、CGRP、CRF阳性细胞表达率,并进行统计学分析。结果表明:乙酸法内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT、P物质、CGRP阳性细胞表达率明显高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）。经过药物治疗后,康泰胶囊中、高剂量组结肠粘膜5-HT阳性细胞表达率明显低于模型组（P＜0.05）;康泰胶囊低、中、高剂量组结肠粘膜P物质阳性细胞表达率显著低于模型组（P＜0.01）;康泰胶囊低、中、高剂量组结肠粘膜CGRP阳性细胞表达率也显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。母子分离法内脏高敏感性模型结肠粘膜5-HT、CRF阳性细胞表达率显著高于正常对照组（P＜0.01）;经过药物治疗后,康泰胶囊低、中、高剂量组结肠粘膜5-HT阳性细胞表达率明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）;康泰胶囊中、高剂量组结肠粘膜CRF阳性细胞表达率显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。提示康泰胶囊能降低乙酸法内脏高敏感性模型结肠粘膜P物质、5-HT、CGRP的表达,也能降低母子分离法内脏高敏感性模型结肠粘膜5-HT、CRF的表达,对以上递质的调节可能是其治疗内脏高敏感性作用的机理之一。4康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT3、5-HT4及CRF1受体基因表达的影响已有研究认为在参与了内脏感知超敏的各种5-HT受体中,5-HT3和5-HT4受体参与一个长时程的痛觉过敏反应。CRF1在脑内多个核团的分布及在外周结肠的分布,与应激诱导的肠道功能与内脏高敏感性关系密切。我们在前面研究工作的基础上,研究了两种内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT3和5-HT4及CRF1mRNA基因表达,并评价康泰胶囊对上述指标的调节作用,以期对康泰胶囊治疗内脏高敏感性作用机理进行探讨。采用三个剂量对两种内脏高敏感性大鼠模型进行治疗,治疗结束后采集结肠粘膜标本。用Trizol提取总RNA进行逆转录反应,以β-actin作为内参进行PCR反应,产物进行凝胶电泳分离,经染色后进行灰度分析,分别以5-HT3、5-HT4的灰度值与β-actin灰度值的比值及5-HT3、CRF1的灰度值与β-actin灰度值的比值作为相对表达量,进行组间比较分析。结果表明:乙酸法内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT3受体基因相对表达量显著高于正常组（P＜0.05）,结肠粘膜5-HT4受体基因相对表达量明显低于正常组（P＜0.05）;经过药物治疗后,康泰胶囊中、高剂量组5-HT3相对表达量明显低于模型组（P＜0.01）,康泰胶囊中、高剂量组5-HT4相对表达量也显著高于模型组（P＜0.01）。母子分离法内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT3受体基因相对表达量明显高于正常组（P＜0.05）,结肠粘膜CRF1受体基因相对表达量明显高于正常组（P＜0.05）;经过药物治疗后,康泰胶囊中、高剂量组5-HT3相对表达量明显低于模型组（P＜0.01）,康泰胶囊中、高剂量组CRF1相对表达量显著低于模型组（P＜0.01）。提示康泰胶囊对两种内脏高敏感性大鼠模型结肠粘膜5-HT3、CRF1基因表达有抑制作用,对5-HT4基因表达有增强作用;对上述受体基因表达的调节作用,可能是其治疗内脏高敏感性的机理之一。5结论本研究结果显示,与正常组比较,模型对照组结肠粘膜5-HT、SP、CGRP及5-HT3和CRF1受体表达均有显著增高,5-HT4受体表达下降。康泰胶囊治疗治疗后,以上各项指标均明显改善,提示康泰胶囊对内脏高敏感性大鼠的治疗作用可能是通过降低肠道5-HT、SP、CGRP的表达,下调受体5-HT3和CRF1的表达以及上调5-HT4的表达,这可能是康泰胶囊治疗内脏高敏感性的机理。本研究结果也提示疏肝健脾,和胃安神法对内脏高敏感性具有多层次、多靶点的治疗作用特点。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 一、肠易激综合征的发病机制
• 二、肠易激综合征的治疗研究概况
• 三、肠易激综合征动物模型的研究进展
• 四、内脏高敏感性的研究概况
• 五、肠易激综合征的中医研究
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 实验一 康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠治疗作用
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 参考文献
• 实验二 康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠血清、肠、脑中5-HT及NO的影响
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 参考文献
• 实验三 康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠结肠P物质、5-HT、CRF及CGRP的影响
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 参考文献
• 实验四 康泰胶囊对两种内脏高敏感性模型大鼠结肠粘膜5-HT3、5-HT4CRF1基因表达的影响
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 参考文献
• 结语
• 一、主要结论
• 二、创新性
• 三、问题与展望
• 附录一:免疫组化照片
• 附录二:英文缩写
• 附录三:在读期间已发表的论文目录
• 致谢