论文摘要
百草枯（Paraquat, PQ）,又名克芜踪（Gramoxone）,化学名为1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶阳离子盐（1,1’-dimethy1-4,4’-bipyridylium）,是目前全球使用最广的除草剂之一。肺脏是PQ中毒的主要靶器官,表现为早期的急性肺损伤,晚期的肺泡内和肺间质纤维化,被命名为“百草枯肺”,呼吸衰竭是PQ中毒的主要死因。国外报道病死率为40%-50%,国内报道病死率达60%-87.5%,是致死性最高的农药中毒事件。迄今为止各国学者仍未明了百草枯的中毒机制,亦无有效拮抗药物。近年来,氧化损伤、核因子-kappaB（nuclear factor-kappaB, NF-κB）信号转导通路、肺细胞因子网络成为急性肺损伤、肺纤维化机制研究中的的热点问题。本研究通过分析氧化应激、NF-κB与细胞因子、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）及其下游效应基因在PQ致大鼠肺损伤中的表达水平及变化规律,探讨PQ中毒致肺损伤尤其是肺纤维化机制,找出PQ中毒的关键点；并通过四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC）的干预,在验证PQ致肺损伤机制假设的同时,探讨PDTC的干预效果及可能机制,为寻找潜在的有效治疗途径提供理论基础和线索。本课题包括PQ致肺损伤机制研究与PDTC对PQ致肺损伤的干预作用两部分内容。通过建立整体动物模型,SD大鼠144只随机分为对照组6只、PDTC对照组36只、PQ染毒组56只、PDTC干预组46只。染毒组和干预组给予生理盐水稀释PQ 80mg/kg一次性灌胃后2h,干预组给予PDTC100mg/kg一次性腹腔注射,染毒组给予等量生理盐水腹腔注射；对照组和PDTC对照组于生理盐水1 ml/kg灌胃后2h, PDTC对照组给予PDTC100mg/kg一次性腹腔注射,对照组给予等量生理盐水腹腔注射。于不同处理后1、3、7、14、25、56d观察大鼠中毒表现及采集血清、肺组织样本。采用试剂盒检测血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）活性以及肺组织羟脯氨酸（Hyp）含量；组织微列阵（TMA）免疫组化检测NF-κB p65的细胞定位及表达强度、电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测肺组织NF-κB活性及变化规律；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中细胞因子白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）及血小板衍生生长因子（PDGF）的水平及变化规律；SABC免疫组化观察肺组织结缔组织生长因子（CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的细胞定位和表达强度、免疫印迹法（Western blot）检测CTGF、α-SMA蛋白表达的动态变化；采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测肺组织纤维连接蛋白（Fn）、整合素α5、I型胶原（ColI）mRNA水平；HE、Masson染色进行肺组织病理学观察及半定量分析、透射电镜进行肺组织超微结构观察。PQ染毒对氧化还原平衡影响的研究显示：（1）染毒组大鼠在染毒后1d血清MDA含量急剧上升,之后逐渐下降。与对照组和PDTC对照组比较,1、3、7dMDA含量明显高于对照组（P<0.01）；干预组与染毒组比较,MDA含量3、7d明显降低（P<0.01）,与两个对照组比较,MDA含量1、3、7d明显升高（p<0.01）。（2）大鼠染毒后GPx活力呈先降低后逐渐上升的趋势。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组1、3、7、14d GPx活力降（p<0.05或P<0.01）；干预组与染毒组比较,1、3、7、14d GPx活力升高,差异有统计学意义（P<0.01）,与两个对照组比较,仅3、7d GPx活力降（p<0.05或P<0.01）。（3）大鼠染毒后1d血清SOD活力急剧下降,之后逐渐上升。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组1、3、7d SOD活力明显下降（P<0.01）；干预组1、3、7d活力明显升高（P<0.05或P<0.01）,但低于对照组水平（P<0.01）。（4）大鼠染毒后1、3d CAT活力迅速下降,之后逐渐上升。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组1、3、7d CAT活力明显降低（P<0.01）；干预组与染毒组比较,1、3d CAT活力较高（P<0.01）,但低于对照组水平（P<0.01）。（5）大鼠染毒后1-14d血清MPO活力逐渐上升,28d开始下降但维持在较高水平。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组各时点的MPO活性均显著升高（P<0.01）；干预组各时点的MPO活性降低,但仅14d差异有统计学意义（P<0.05）,与对照组比较,1、3、7、14d活性升高（P<0.05）。PQ染毒对肺组织NF-κB活性及血清相关细胞因子水平影响的研究显示：（1）肺组织NF-κB活性变化显示,NF-κB p65阳性细胞主要在支气管粘膜柱状上皮细胞、肺泡上皮、巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞的胞浆或／和胞核里表达；蛋白表达强度及变化规律与EMSA检测结果较为一致。对照组NF-κB活性极低。染毒组大鼠肺组织NF-κB活性于1d明显升高,3d达到高峰,7、14 d逐渐降低,但仍维持在较高水平,28d迅速降低,接近对照组的水平。与对照组比较,染毒组肺组织NF-κB1、3、7、14d活性明显升高（P<0.05或P<0.01）；干预组大鼠肺组织NF-κB活性变化规律与染毒组类似,1、3、7、14d活性较染毒组明显降低（p<0.05或P<0.01）,但1、3、7d活性高于对照组（P<0.05或P<0.01）。（2）血清细胞因子水平显示,与对照组比较,染毒组大鼠血清IL-1β水平于1、3、7d明显升高（P＜0.01）; TGF-β1、TNF-α水平各时点均显著升高（P＜0.01）; PDGF含量于7、14、28、56d明显升高（P<0.01）；经PDTC干预后,血清IL-1β、TGF-β1、TNF-α、PDGF水平明显降低,相应时点差异有统计学意义（p<0.05或P<0.01）。（3）相关性分析显示,IL-1β水平与肺脏系数成正相关（r=0.37, P＜0.05）, TNF-α水平与肺脏系数成正相关（r=0.46, P＜0.01）, TGF-β1水平与Hyp含量成正相关（r=0.56, P＜0.01）, PDGF水平与Hyp含量成正相关（r=0.89,P<0.01）。PQ染毒对CTGF,α-SMA及其下游效应基因表达水平的影响：（1）免疫组化显示,染毒组3d即有CTGF阳性表达,表达强度较弱,主要表达于肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及以巨噬细胞为主的炎症细胞等；7、14d表达进一步增强,主要表达部位除上述细胞外出现成纤维细胞；28、56d表达持续增强,主要表达部位为巨噬细胞和大量成纤维细胞。干预组CTGF阳性表达细胞与染毒组相同,但各时段表达强度均显著降低（P<0.05或P<0.01）。染毒组3、7d在肺泡间隔中开始出现少量a-SMA免疫反应阳性的成纤维细胞；14d随着纤维组织增生,a-SMA免疫反应阳性的成纤维细胞大量出现,表达强度急剧增强；28-56d随着大面积纤维组织出现,a-SMA免疫反应阳性的成纤维细胞继续增多,表达持续增强。干预组CTGF阳性表达细胞明显减少,各时点表达强度显著降低（P<0.05或P＜0.01）。（2） Western blot显示,染毒后大鼠肺组织的CTGF、α-SMA蛋白表达的变化规律与免疫组化较为一致,均随时间延长而逐渐升高,3-7d升高幅度缓慢,14-56d增幅较大,各时段明显高于对照组（P<0.05或P＜0.01）; PDTC干预后CTGF、α-SMA蛋白表达在各时段均显著下（p<0.05或P<0.01）。（3）RT-PCR显示,染毒后大鼠肺组织Fn, ColI,整合素α5 mRNA表达水平均明显升高,其中Fn、整合素α5 mRNA变化规律类似,均表现为染毒1、3d基因表达即刻增高,但增幅平缓,14-56d增幅剧烈。与对照组比较,染毒组Fn mRNA水平各时段均明显升高（P<0.05或P<0.01）；整合素α5 mRNA 3-56d基因表达显著增强（p<0.05或P＜0.01）;1、3d Coll mRNA表达无明显变化,7d表达略微增强,14-56d ColI mRNA水平大幅度升高,与对照组比较3-56d mRNA水平明显升高（p<0.05或P＜0.01）。PDTC干预后显著降低大鼠肺组织各时段的Fn, Coll,整合素α5 mRNA水平（P<0.05或P<0.01）。（4）相关性分析显示,CTGF与病理评分、Hyp含量成正相关,相关系数分别为0.87、0.71P<0.01)；与a-SMA蛋白水平、Fn、ColI、整合素α5 mRNA水平均为显著的正相关关系,相关系数分别为0.74、0.68、0.83、0.74（P＜0.01）。α-SMA与病理评分、Hyp含量成正相关,相关系数为0.68、0.88（P<0.01）。病理学检测显示,PQ中毒后肺损伤病理改变分为损伤期和增殖期。（1）光镜观察：染毒早期（1-7d）病理特征为急性肺泡炎,表现为肺充血、肺水肿及炎性细胞浸润。后期（14-56d）炎性病变减轻,支气管周围、肺泡间隔及肺泡内大量成纤维细胞增殖、胶原纤维不规则排列,病变严重处见纤维瘢痕样组织,无肺泡结构。干预组的肺部炎性改变及胶原纤维增生程度均明显减轻。（2）电镜观察：染毒组大鼠部分肺泡Ⅰ型上皮细胞受损,Ⅱ型上皮细胞变性、坏死、脱落、基膜断裂,细胞核染色质边集,线粒体肿胀,板层小体排空现象明显,以3、7d变化最为明显。后期可见线粒体结构破坏,板层小体空泡化,胶原纤维不规则排列。PDTC干预后上述病变程度明显减轻。肺脏系数及肺组织Hyp含量检测显示,染毒组大鼠肺脏系数随时间延长逐渐升高,7d达到高峰,14d迅速下降,28、56d再次呈现升高趋势,各时段均明显高于对照组（p<0.01）；干预组3、7、28、56d肺脏系数明显降低（p<0.01）,但各时段肺脏系数高于对照组（P<0.01）。染毒组与干预组肺组织Hyp含量均于7d后逐渐升高。与对照组比较,染毒组14、28、56d肺组织Hyp含量明显升高（P<0.01）；干预组28、56d肺组织Hyp含量与染毒组比较明显降低,但高于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。综上,氧化应激是参与PQ致早期肺损伤的重要机制；作为NF-κB的刺激因素之一,通过诱导NF-κB活化,导致细胞因子网络调控失衡、相关细胞因子过度表达,参与PQ所致的急性肺损伤/肺纤维化发生发展；其中TGF-β1作为纤维化的“总开关”细胞因子,它可能通过多条信号转导通路诱导CTGF持续过度表达,使其作为下游效应分子介导其促纤维化效应,表现为α-SMA蛋白的表达增强,FN、ColI、整合素α5 mRNA水平的显著升高,最终导致肺成纤维细胞增殖、转化及细胞外基质的沉积。PDTC作为强抗氧化剂及NF-κB抑制剂,一方面能够纠正PQ所致的氧化还原失衡,另一方面通过抑制NF-κB活化,进而降低相关细胞因子水平,及下游致纤维化效应基因的表达,减轻肺部炎症及纤维化程度。在验证我们的PQ致肺损伤机制假设同时,也为PQ中毒的有效治疗提供线索,其干预机制仍有待于进一步研究。