论文摘要
中枢神经系统（central nervous system, CNS）髓鞘的形成是由少突胶质细胞（oligodendrocytes, OLs）完成的,是维持正常神经冲动传导的重要物质基础。但是,由于少突胶质细胞对损伤因子很敏感,当CNS损伤时,少突胶质细胞很容易受到损害而死亡或凋亡,导致脱髓鞘或再生的轴突不能髓鞘化。伴随CNS创伤出现的一种特征性病理变化就是轴突脱髓鞘,且多不能自发再髓鞘修复,其中一个重要原因,可能就是与OLs减少和不能及时得到补充有关。室管膜下区的少突胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells, OPCs）定向迁移可能对OLs的补充具有重要意义。虽然目前对与少突胶质细胞系的发育有关的细胞因子（如GGF、PDGF、bFGF等）有了较深入了解,但是却对如何诱导OPCs迁移及其迁移机制知之甚少。由于神经元和少突胶质细胞之间存在密切的相互作用关系,因此,调控神经元轴突塌陷和定向的分子也可能对OPCs迁移产生影响。近年来发现的诱导分子Semaphorin3A（Sema3A）及其受体就是对轴突生长和神经元定向迁移发挥着重要作用。那么Sema3A是否对OPCs细胞迁移过程产生调控作用呢?在此过程中其信号传导机制如何呢?目前还不清楚。本文通过对传统的培养、纯化方法进行改良,从新生大鼠室管膜下区分离出高纯度的OPCs,转染增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因,使其携带绿色荧光;并利用DNA重组技术制备表达Sema3A-Fc融合蛋白的COS-7细胞,用millicell-PCF细胞迁移小室（孔径8um）进行细胞迁移试验,观察Sema3A-Fc对OPCs迁移的影响及并探讨可能的信号传导机制。研究目的:1、观察Sema3A-Fc对少突胶质细胞祖细胞迁移的影响;2、探讨cAMP-PKA、cGMP-PKG和RhoA-ROCK信号通路在Sema3A-Fc诱导少突胶质细胞祖细胞迁移中的作用;3、试图阐明Sema3A诱导少突胶质细胞祖细胞迁移中可能的信号机制。实验方法1、少突胶质细胞祖细胞的分离培养与鉴定在解剖显微镜下切取新生SD大鼠室管膜下区脑组织进行细胞培养,培养基为含10%小牛血清和10%胎牛血清的DMEM。细胞分层时由于OPCs生长在星形胶质细胞层上面,根据贴壁能力差异,采用差速振荡法分离上层的OPCs。OPCs采用DMEM/F12培养基（含2%B27,20ng/L bFGF和20ng/L PDGF-AA）进行扩增培养。分别用无血清培养基和血清培养基对OPCs进行促分化培养。分别选取少突胶质细胞系不同发育期标志性抗原（A2B5、GFAP和CNPase）,采用间接免疫荧光染色技术对所培养的细胞进行类型鉴定。EGFP质粒转染体外培养的少突胶质细胞祖细胞,挑选成功转染GFP的少突胶质细胞祖细胞扩增培养备用。2、表达Sema3A-Fc的COS-7细胞的制备利用基因重组技术,构建Sema3A-Fc重组质粒,利用双酶切、基因测序进行重组质粒鉴定;脂质体法转染COS-7细胞,G418筛选抗性克隆,扩增培养,免疫组化和免疫印迹法鉴定重组蛋白表达情况,获得稳定表达Sema3A的COS-7细胞。用含有sema3A-Fc培养上清加入体外培养的OPCs培养瓶中,通过对比观察构建表达的sema3A-Fc是否具有生物学活性。并对细胞膜上NP-1受体进行了检测。3、Sema3A-Fc诱导少突胶质细胞祖细胞迁移信号机制的实验研究1)用millicell-PCF细胞迁移小室（孔径8um）进行细胞迁移试验。将稳定表达Sema3A-Fc的COS-7细胞培养在迁移仓下层,待细胞融合达70%以上后,将纯化培养的少突胶质细胞祖细胞按2×104/孔接种在迁移仓的上层,共培养12h后,固定细胞,甲苯胺蓝染色,计数迁移细胞数。设对照组:单纯培养基对照和转染pIG的COS-7对照组。2)PKA和PKG的激活实验:分别加入cAMP类似物8-溴-cAMP（浓度50μM）,cGMP类似物8-溴-cGMP（浓度500μM）于分层迁移实验舱下层中,观察少突胶质细胞祖细胞的迁移情况,计数并比较迁移结果。3)PKA和PKG抑制实验:分别加入PKA的特异性抑制物KT5720（浓度10μM）和PKG的特异性抑制物KT5823（浓度1μM）于分层迁移实验舱下层中,观察少突胶质细胞祖细胞的迁移情况,计数并比较迁移结果。4)抑制Rock激酶试验:分别在上述实验组中加入有Rho活性的ROCK激酶抑制物Y27632（浓度10μM）,分别观察少突胶质细胞祖细胞的迁移情况,计数并比较迁移结果。5)免疫荧光法检测PKA催化亚基和PKG1含量:分别用小鼠抗PKA催化亚基抗体和兔抗PKG1抗体做为一抗,PBS替代一抗作阴性对照,在相同条件下进行免疫荧光染色和照相。用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件,对图像进行分析处理。6)观察PKG,PKA和ROCK活性对OPCs细胞迁移的直接作用。在没有sema3A-Fc存在的情况下,用8-Br-cAMP, 8-Br-cGMP, KT5720、KT5823和Y 27632直接作用于OPCs细胞（浓度同前）,观察PKG,PKA和ROCK活性改变是否对体外培养的OPCs细胞迁移的产生直接影响。4、统计定量数据以均数±标准差（ x±s）表示,用SPSS10.0统计软件对数据进行分析,使用独立样本t检验分析两个组间的差异,使用单因素方差分析比较多个组间统计学差异。以P < 0.05为有统计学差异,以P < 0.01为有显著差异。主要结果1、体外成功分离培养出少突胶质细胞祖细胞,A2B5标记阳性,纯度达到95%以上。并能进一步分化为CNPase标记阳性的少突胶质细胞和GFAP标记阳性Ⅱ型星形胶质细胞。2、成功构建了pIGsema3A-Fc重组质粒,经双酶切（HindⅢ和BamHⅠ）和基因测序鉴定正确,转染COS-7细胞后,经免疫组化和Western-blot检测到重组蛋白的表达。表达Sema3A-Fc的COS-7细胞的培养上清能够促使体外培养的OPCs细胞突起回缩,胞体变圆。用抗Fc抗体和抗NP-1抗体免疫荧光染色均呈膜性染色。3、sema3A-Fc诱导细胞迁移实验结果:Sema3A-Fc实验组OPCs迁移数为（24.3±6.7）,单纯培养基对照组为（38.4±7.9）,转染pIG的COS-7对照组为（37.7±8.3）,实验组与两个对照组均存在明显差异（n=15, P <0.01）。4、OPCs细胞内PKG、PKA免疫组化检测:通过针对催化亚基的抗体用免疫荧光法对细胞内PKA和PKG进行检测,发现OPCs细胞内的PKA和PKG均有基础量的表达,主要分布在胞浆和突起内。当加入含sema3A-Fc的培养上清时,细胞内PKA催化亚基染色强度没有明显变化,而PKG1的染色强度则较对照组明显增高（P <0.01）,表明PKG含量增加,活性增强。表明含sema3A-Fc激活了cGMP-PKG信号通路。5、PKA和PKG激活/抑制实验:OPCs迁移数分别为:8-溴-cAMP组OPCs迁移数为（32.6±7.3）较对照组（24.3±6.7）明显增加（P <0.01）,8-溴-cGMP组为（19.3±5.5）较对照组（24.3±6.7）有减少明显（P <0.05）。PKA和PKG抑制实验:OPCs迁移数分别为:KT5720组（17.5±5.3）较对照组（24.3±6.7）明显减少（P <0.01）。KT5823组（29.9±6.2）较对照组（24.3±6.7）有明显增加（P <0.05）。表明PKG通路对sema3A信号具有正向调节作用,而PKA通路则具有负向调节作用。6、抑制ROCK激酶试验:Y27632干预前后的成对数据的统计结果为,对照组（37.7±8.3）对（38.4±8.2）,sema3A-Fc组（24.3±6.7）对（35.3±8.7）,8-溴-cAMP组（32.6±7.3）对（32.4±7.6） , 8-溴-cGMP组（19.3±5.5）对（29.9±6.2） , KT5720组（17.5±5.3）对（26.5±5.7）,KT5823组（29.9±6.2）对（36.9±7.7）。单因素方差分析示组间有明显差异（P =0.012）。表明ROCK激酶抑制剂Y27632能明显抑制sema3A-Fc对OPCs细胞迁移的作用,间接证明Sema3A激活了OPCs细胞内的Rho-ROCK信号通路。7、在去除Sema3A-Fc情况,单独应用8-Br-cGMP、8-Br-cAMP、KT5720、KT5823和Y27632并不能改变OPCs原有的迁移能力。结果为:8-溴-cAMP组（36.8±7.1）,8-溴-cGMP组（35.1±7.4）,KT5720组（37.5±8.1）,KT5823组（34.9±7.6）,均与对照组（37.7±8.3）无明显差异（n=15, P>0.05）。但与sema3A-Fc存在时的数据进行配对比较则有明显差异（P<0.05）。全文结论1、通过二次接种和差速振荡法,成功分离出高纯度少突胶质细胞祖细胞,传代及分化培养,通过免疫组化法鉴定了细胞类型。脂质体法成功导入EGFP基因,成为可示踪的少突胶质细胞祖细胞。2、成功构建了pIGsema3A-Fc真核表达载体,通过脂质体法成功转染COS-7细胞,表达出具有生物活性的sema3A融合蛋白。3、Sema3A-Fc对体外培养的OPCs细胞迁移具有排斥作用;Sema3A-Fc对OPCs的排斥作用可能是通过激活cGMP-PKG和Rho-ROCK信号通路介导的,而cAMP-PKA信号通路没有直接参于该效应,但对该效应具有明显的负向调节作用。4、Sema3A-Fc诱导OPCs细胞迁移的信号转导机制是非常复杂的,cGMP-PKG和Rho-ROCK信号通路只是其中的一小部分,可能还存在其它的作用机制,尚需要更深入的研究。
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