过量表达LeHSP21.5减缓番茄的UPR应答并增强其耐逆性

论文摘要

真核细胞内质网中未折叠蛋白的积累会引起内质网胁迫(ER stress),激活未折叠蛋白应答(UPR)信号途径,从而诱导内质网中分子伴侣的表达(比如BiP和Calnexin等)。目前关于内质网中分子伴侣在UPR应答机制中作用的研究主要集中于高分子量热激蛋白,而对小分子热激蛋白相关的研究较少。我们通过对番茄LeHSP21.5蛋白的表达特性和亚细胞定位分析,发现其为典型的内质网定位的小分子热激蛋白。为研究内质网小分子热激蛋白在UPR信号系统中的功能,我们构建了LeHSP21.5基因的真核表达载体并转化番茄,获得了过量表达内质网小分子热激蛋白的转基因株系,并分析了在各种逆境胁迫下,转LeHSP21.5基因番茄中的UPR应答反应。主要结果如下:1、Northern和Western杂交均表明LeHSP21.5基因是一个热诱导型基因,但其启动子并非高效,且其表达不受低温和高盐的诱导;Southern杂交结果表明,该基因在番茄基因组中是单拷贝;LeHSP21.5蛋白在膜微囊泡各片层中的分布趋势同内质网标志蛋白Calnexin的分布一致,初步说明LeHSP21.5蛋白定位于内质网中。2、将LeHSP21.5的全长cDNA序列构建到组成型启动子(CaMV 35S)控制的pROK2真核表达载体中,转化农杆菌LBA4404,通过农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄,获得了过量表达LeHSP21.5基因的转基因番茄,通过Southern杂交证实外源基因已整合入番茄基因组,Northern杂交证实,外源LeHSP21.5基因在常温条件下的番茄转基因株系中呈现组成型表达,但不同的转基因株系LeHSP21.5表达信号强度有所差别。非胁迫条件下转基因番茄的生长发育与对照之间没有可见差异,说明外源基因的转入未影响植物的正常生长。3、比较转LeHSP21.5基因番茄和未转基因番茄在ER stress诱导剂(衣霉素和DTT)处理下的生活力和存活率,发现过量表达LeHSP21.5蛋白提高了转基因番茄整株植物对衣霉素等的抗性。Northern分析结果表明,衣霉素处理使未转基因番茄中BiP、PDI和calnexin mRNA和蛋白的诱导表达量迅速升高,转基因番茄中这些分子伴侣的表达量也有所增加,但表达强度明显低于未转基因番茄。基于以上实验数据,本文首次证明LeHSP21.5能够减轻ER stress。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 第一部分 文献综述
• 1 热激蛋白与分子伴侣
• 1.1 植物HSPs 的种类、功能和胁迫表达
• 1.2 植物sHSPs 的分类
• 1.3 植物sHSPs 的表达
• 1.4 植物sHSPs 的功能
• 1.5 植物HSPs 研究存在的问题与展望
• 2 内质网分子伴侣与胁迫
• 2.1 内质网分子伴侣
• 2.2 内质网胁迫（ER stress）
• 2.3 未折叠蛋白应答（unfold protein response, UPR）
• 2.4 ER stress 与程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）
• 2.5 UPR 研究存在问题与展望
• 3 植物的低温胁迫耐受机制
• 3.1 低温伤害（冷害）
• 3.2 植物耐冷机制
• 3.3 提高植物抗寒性存在的问题与展望
• 4 植物盐胁迫耐受机制
• 4.1 渗透稳态的维持
• 4.2 晚期胚胎发生富集蛋白（LEA 蛋白）与耐盐胁迫
• 4.3 盐胁迫下离子稳态的维持
• 4.4 SOS 信号通路
• 4.5 去除毒害
• 4.6 提高植物耐盐性存在的问题与展望
• 第二部分 实验论文
• 第一章 LeHSP21.5 的分子生物学特性分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 质粒的提取
• 2.2 质粒的纯化、酶切和连接
• 2.3 质粒的转化
• 2.4 番茄LeHSP21.5 基因的分子克隆
• 2.5 番茄LeHSP21.5 基因的Southern 分析
• 2.6 番茄植株生长与热激等胁迫处理
• 2.7 番茄LeHSP21.5 基因的Northern 分析
• 2.8 番茄LeHSP21.5 蛋白的Western 分析
• 2.9 LeHSP21.5 蛋白的亚细胞定位分析
• 3 实验结果
• 3.1 LeHSP21.5 系统进化分析
• 3.2 LeHSP21.5 基因在番茄基因组中的Southern 杂交分析
• 3.3 LeHSP21.5 基因的表达特性
• 3.4 LeHSP21.5 蛋白的热诱导表达分析
• 3.5 LeHSP21.5 蛋白的膜微囊泡定位分析
• 4、讨论
• 4.1 LeHSP21.5 基因的热诱导表达特征
• 4.2 LeHSP21.5 为内质网定位的小分子热激蛋白
• 第二章 转LeHSP21.5 基因番茄植株的获得及UPR 分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体的构建
• 2.2 植物表达载体的农杆菌转化
• 2.3 番茄的培养与转化
• 2.4 转基因番茄的遗传学分析
• 2.5 转基因番茄的PCR 分析
• 2.6 转基因番茄的Southern 分析
• 2.7 转基因番茄的Northern 分析
• 2.8 转基因番茄的Western 分析
• 2.9 转基因番茄的DTT 抗性分析
• 2.10 转基因番茄的衣霉素抗性分析
• 3 实验结果
• 3.1 LeHSP21.5 基因过量表达载体的构建以及番茄的转化
• 3.2 转LeHSP21.5 基因番茄的PCR 鉴定和遗传学分析
• 3.3 转LeHSP21.5 基因番茄的分子鉴定
• 3.4 过量表达LeHSP21.5 增强番茄的DTT 抗性
• 3.5 过量表达LeHSP21.5 减缓DTT 处理下Calnexin 的表达
• 3.6 过量表达LeHSP21.5 增强番茄的衣霉素抗性
• 3.7 过量表达LeHSP21.5 减缓了衣霉素诱导的UPR
• 4 讨论
• 第三章 转LeHSP21.5 基因番茄植株的耐温度胁迫分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 番茄的耐热性分析
• 2.2 番茄的耐冷性分析
• 2.3 基本生理指标的测定
• 2.4 果实耐冷藏指标的测定
• 2.5 低温胁迫下植物的Northern 分析
• 3、结果与分析
• 3.1 过量表达LeHSP21.5 对植物耐热性的影响
• 3.2 过量表达LeHSP21.5 提高番茄植株的耐冷性
• 3.3 过量表达LeHSP21.5 提高番茄果实的耐冷藏性
• 3.4 过量表达LeHSP21.5 减缓了低温下番茄中的UPR 应答
• 4 讨论
• 4.1 过量表达LeHSP21.5 增强转基因番茄的耐冷性
• 4.2 转LeHSP21.5 基因番茄耐冷机制的探讨
• 4.3 过量表达LeHSP21.5 蛋白没有增强番茄的耐热能力
• 第四章 转LeHSP21.5 基因番茄的耐盐性分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 番茄的盐胁迫处理
• 2.2 基本生理指标的测定
• 2.3 盐胁迫下植物的Northern 和Western 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 盐胁迫下转LeHSP21.5 基因植株的表型
• 3.2 盐胁迫对转基因植株与对照植株鲜、干重和相对含水量的影响
• +、K⁺、Ca²⁺含量及K⁺/Na⁺比的影响'>3.3 盐胁迫对转基因植株与对照植株体内Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量及K⁺/Na⁺比的影响
• 3.4 盐胁迫对转基因植株与对照植株体内脯氨酸和可溶性糖含量的影响
• 3.5 盐胁迫对转基因植株与对照植株MDA 含量和相对电导率的影响
• 3.6 盐胁迫对转基因植株与对照植株体内SOD 酶活的影响
• 3.7 盐胁迫对转基因植株与对照植株叶绿素含量的影响
• 2 的浓度和气孔导度的影响'>3.8 盐胁迫对转基因与对照植株叶片光合速率、细胞间隙CO₂的浓度和气孔导度的影响
• 3.9 盐胁迫对转基因植株与对照植株最大光化学效率PSⅡ的影响
• 3.10 过量表达LeHSP21.5 减缓了盐胁迫下番茄中的UPR 应答
• 4 讨论
• 4.1 过量表达LeHSP21.5 减轻了盐胁迫造成的ER stress
• 4.2 过量表达LeHSP21.5 增强转基因番茄耐盐性机理的探讨
• 第五章 过量表达LeHSP21.5 减缓UPR 机理的初步探讨
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 酵母基因组的提取
• 2.2 酵母表达载体pPDIy-ER 和pBiPy-ER 的构建
• 2.3 酵母的转化
• 2.4 重组蛋白在酵母细胞中的诱导表达
• 2.5 酵母蛋白的提取
• 2.6 酵母重组蛋白的检测
• 2.7 转LeHSP21.5 基因酵母的UPR 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 酵母表达载体pBiPy-LeHSP21.5 和pPDIy-LeHSP21.5 的构建
• 3.2 外源蛋白的Western 分析
• 3.3 转LeHSP21.5 基因酵母的衣霉素抗性分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间整理发表的论文
• 致谢
• 图版