柴胡皂苷a对谷氨酸激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞的干预作用

论文摘要

一目的与意义癫痫是一种严重危害人类健康的神经系统疾病,在我国癫痫的患病率为4.6‰。由于社会传统的偏见,癫痫病人及家属常隐瞒或否认自己的病情,并承受很大的心理压力。由癫痫引起的医疗、家庭和社会问题极为显著。目前常用一线抗癫痫药（AEDs）可使大部分癫痫患者发作得以控制,但长期应用安全性较差,对于一些难治性癫痫行外科手术治疗,也受到适应症的限制,风险大,费用昂贵,还存在复发的可能。因此难治性癫痫仍然以药物治疗为主要手段,这就需要使用新的抗癫痫药,但其研究前提是对于癫痫发病机制的深入认识。近年来癫痫的发病机制研究有了长足进步。神经元兴奋性增高和高度同步化发放是癫痫发病的两个重要特征已得到公认,国内外很多学者试图从多个方面来探索引起神经元兴奋性增加和高度同步化发放的形成机制,提出了不少有益的见解。其中对星形胶质细胞与神经信号传递的认识逐步深入,位于突触联合处的星形胶质细胞被认为是突触三联体的重要组成部分。谷氨酸（Glu）作为中枢神经系统的主要的兴奋性神经递质,是重要的致痫原因,既可导致癫痫发作,又可能在癫痫的继发性脑损害中起重要作用。正常情况下,神经元将Glu释放到突触间隙,然后由星形胶质细胞摄取后再转化为谷氨酰胺,这种神经元与星形胶质细胞间的谷氨酸-谷氨酰胺循环在正常神经系统功能中起着重要作用,这种循环一旦遭破坏即可导致Glu在突触间隙大量堆积,使神经元处于高度兴奋的状态,从而致使惊厥形成。神经系统损伤时,往往伴随星形胶质细胞的活化,又称反应性胶质增生（Reactive gliosis）,首要特征是其重要的骨架蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加,激活的星形胶质细胞对神经突触传递施加影响,可以通过多种途径来作用于神经元,增加神经元兴奋性,进而引起癫痫的发作。柴胡皂苷a（SSa）为我国传统中药柴胡主要药理成分柴胡皂苷的一种单体成分,柴胡皂甙具有公认的抗炎、免疫调节作用,并且在我们前期的研究基础上发现柴胡总皂苷和SSa可以抗实验性癫痫、抑制慢性点燃大鼠GFAP的表达,调节海马Glu的表达,故我们推测SSa可以通过抑制Glu对神经系统作用和抑制其激活的星形胶质细胞来发挥抗实验性癫痫的作用。而目前体外SSa抗癫痫机制研究尚不明确,本实验由广东省中管局课题基金（NO.1060133）资助研究了SSa对Glu激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞的干预作用,探讨SSa可能的抗癫痫机制。二方法与内容1大鼠海马星形胶质细胞的培养与鉴定星形胶质细胞的原代培养参考McCarthy法。取新生SD大鼠海马,剪碎,消化,离心,差速贴壁40 min后,按106个/cm2接种。37.0℃,5%CO2孵箱中培养7-9 d,待培养的细胞70%-80%融合时,将培养瓶置于恒温旋转摇床上摇18 h（37.0℃,240 r/min）后,进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞,纯化的细胞进一步运用免疫细胞化学SABC法进行鉴定。2 SSa对Glu激活体外培养的大鼠海马星形胶质细胞活性的影响运用MTT比色法检测各组星形胶质细胞活细胞数量。将传代细胞按8×104个/cm2的密度接种于96孔培养板中,每孔200μl。完全培养基培养48 h后,用含5%胎牛血清的培养基配制药物干预组共6组:a组为正常组（control组）,b组为L-Glu（1.5 mmol/L）的激活组,c组为L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5mmol/L,10 mg/L）,d组为含L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5 mmol/L,5 mg/L）,e组为含L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5 mmol/L,2.5 mg/L）,f组为含L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5 mmol/L,1.25 mg/L）。每组6孔,每孔加入200μl,继续培养72 h后运用MTT法测OD值,以OD值反映各组星形胶质细胞活细胞数量。3 SSa对Glu激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞分裂周期的影响运用流式细胞技术检测各组星形胶质细胞的细胞周期。将传代细胞以5×105个/cm2密度种植于直径10 mm的培养皿中。完全培养基培养48 h后,用DMEM/F12培养基配制药物干预组共5组:a组为正常组（control组）,b组为L-Glu（1 mmol/L）的激活组,c组为L-Glu+SSa剂量组（分别为1 mmol/L,5mg/L）,d组为L-Glu+SSa剂量组（分别为1 mmol/L,2.5 mg/L）,e组为含L-Glu+SSa剂量组（分别为1 mmol/L,1.25 mg/L）。在加药24 h后取材,PI染色并调整细胞密度为106个/cm2,而后用流式细胞技术检测各组星形胶质细胞细胞周期,每组样本检测104个细胞,以细胞指数表示分布于细胞周期各时相的细胞百分比数,以增殖指数反映细胞增殖状态。4 SSa对Glu激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响运用Western-blot法检测各组星形胶质细胞GFAP表达量。将传代细胞以5×105个/ml的密度种植于培养皿中,完全培养基培养48 h后,用DMEM/F12培养基配制药物干预组共5组:a组为正常组（control组）,b组为L-Glu（1.5 mmol/L）的激活组,c组为L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5 mmol/L,5 mg/L）,d组为含L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5 mmol/L,2.5 mg/L）,e组为含L-Glu+SSa剂量组（分别为1.5 mmol/L,1.25 mg/L）。作用24 h后,提取蛋白,运用western-blot技术检测GFAP表达的变化,对结果进行灰度分析,计算GFAP与β-actin的比值。每组蛋白检测6次。三统计方法应用SPSS 11.5统计软件进行处理。各组MTT比色法结果和western-blot检测结果比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,进一步组间比较用LSD法;流式细胞技术检测结果比较采用R×C表资料的卡方检验,P＜0.05表示差异具有统计学意义。四结果1星形胶质细胞的培养和鉴定原代培养的大鼠海马星形胶质细胞,镜下观察可见星形胶质细胞生长较好,所有细胞均贴壁。原代培养的星形胶质细胞运用免疫组化染色法鉴定,细胞的GFAP免疫反应阳性率为98%以上。2 Glu对体外培养大鼠海马星形胶质细胞活性的影响及SSa的干预作用体外培养大鼠海马星形胶质细胞在不同处理因素处理下各组OD值,与a组比较,b组、c组、d组、f组OD值均高于a组,差异有显著性意义（P＜0.05）;与b组比较,a组、c组、d组、e组OD值均低于b组,而f组则高于b组,差异有显著性意义（P＜0.05）。结果提示:Glu可以显著激活体外培养星形胶质细胞,促进细胞增殖,而SSa对Glu激活的细胞增殖具有显著抑制作用。3 Glu对体外培养大鼠海马星形胶质细胞分裂周期的影响及SSa的干预作用各组流式细胞技术检测的细胞周期结果:各组细胞增殖指数差异有显著性意义（P＜0.001）。各组细胞增殖指数均高于a组,各组细胞增殖指数均低于b组。结果提示:Glu（1 mmol/L）可以显著激活大鼠海马星形胶质细胞,加速星形胶质细胞的分裂周期。SSa对激活细胞的分裂周期均存在一定的阻滞作用。4 Glu对体外培养大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响及SSa的干预作用各组western-blot检测结果:GFAP表达量b组、c组、e组与a组比较差异均有显著性意义（P＜0.05）;a组、c组、d组GFAP表达量低于b组,差异有显著性意义（P＜0.05）,而e组高于b组,差异有显著性意义（P＜0.05）。提示:Glu可以显著激活大鼠海马星形胶质细胞,促使星形胶质细胞GFAP过度表达,而SSa对其激活存在抑制作用。五结论1 Glu可促进体外培养大鼠海马星形胶质细胞的活性,SSa可抑制激活星形胶质细胞的活性。2 Glu可促进体外培养大鼠海马星形胶质细胞的分裂周期,SSa可阻滞激活星形胶质细胞的分裂周期。3 Glu可促进体外培养大鼠海马星形胶质细胞GFAP的表达,SSa可抑制过度表达的GFAP。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果
• 1 星形胶质细胞的培养和鉴定
• 2 SSa对Glu激活体外培养的大鼠海马星形胶质细胞增殖的影响
• 3 SSa对Glu激活体外培养的大鼠海马星形胶质细胞分裂周期的影响
• 4 SSa对Glu激活体外培养的大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略语表
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢